Kloning

Penemuan-penemuan dalam bidang biologi molekuler telah memungkinkan para ilmuwan untuk menduplikasi fenomena transfer genetik di dalam laboratorium dan mengembangkan metode untuk mengintroduksi hampir semua jenis informasi genetik ke dalam suatu organisme. Teknologi genetik telah mencapai titik dimana kita dapat menciptakan duplikat yang sama dari hewan-hewan tingkat tinggi. Kita telah menghasilkan klon domba dan monyet serta embrio manusia telah berhasil diduplikasi dalam laboratorium. Kelahiran dolly, domba hasil klon yang pertama, memang sebuah kejadian yang penting. Dolly direproduksi tanpa bantuan domba jantan, dari sebuah sel kelenjar susu, bukan dari sel reproduksi, yang diambil secara acak dari seekor domba dewasa.

Gen menjadi dasar dalam pengembangan penelitian genetika meliputi pemetaan gen dan menganalisis posisi gen pada kromosom. Hasil penelitian telah berkembang pesat dengan diketahuinya DNA sebagai material genetik beserta strukturnya, kode-kode genetik serta proses transkripsi dan translasi. Suatu penelitian yang merupakan revolusi dalam biologi modern adalah setelah munculnya metode teknologi DNA rekombinan atau rekayasa genetika yang inti prosesnya adalah kloning gen yang merupakan suatu prosedur untuk memperoleh replika yang dapat sama dari sel atau organisme tunggal.
Kloning pada umumnya adalah perbanyakan DNA rekombinan, yaitu DNA yang sudah direkayasa dengan teknik penggabungan/penyisipan gen dari satu organisme satu ke dalam genom organisme lain (transplantasi gen/teknologi plasmid). Contohnya: kloning gen penghasil insulin dari kelenjar pankreas manusia, disisipkan ke dalam plasmid bakteri Escherichia coli sehingga bakteri tersebut dapat mengekspresikan gen tersebut dan menghasilkan insulin manusia dalam jumlah banyak, mengingat bakteri sangat cepat membelah diri dan bertambah banyak dengan cepat.
Ada beberapa langkah dasar dalam kloning gen, yaitu:
1. Suatu fragmen DNA yang mengandung gen yang akan diklon diinsersikan pada molekul DNA sirkular yang disebut vektor untuk menghasilkan chimera atau molekul DNA rekombinan.
2. Vektor bertindak sebagai wahana yang membawa gen masuk ke dalam sel tuan rumah (host) yang biasanya berupa bakteri, walaupun sel-sel jenis lain dapat digunakan.
3. Di dalam sel host, vektor mengadakan replikasi menghasilkan banyak kopi atau turunan yang identik baik vektornya sendiri maupun gen yang dibawanya.
4. Ketika sel host membelah, kopi molekul DNA rekombinan diwariskan pada progeny dan terjadi replikasi vektor selanjutnya.
5. Setelah terjadi sejumlah besar pembelahan sel, maka dihasilkan koloni atau klon sel host yang identik.
Tiap-tiap sel dalam klon mengandung satu kopi atau lebih molekul DNA rekombinan dan dapat dikatakan bahwa gen yang dibawa oleh molekul rekombinan telah berhasil diklon.

Wahana dan ketrampilan dasar untuk Kloning Gen
Komponen penting dalam eksprerimen kloning gen adalah wahana yang membawa gen masuk ke dalam sel host dan bertanggung jawab atas replikasinya. Untuk dapat bertindak sebagai wahana suatu molekul DNA harus mampu memasuki sel tuan rumah serta dapat mengadakan replikasi untuk menghasilkan kopi dalam jumlah besar.
Dua jenis molekul DNA alamiah yang memenuhi persyaratan tersebut adalah:
1. Plasmid, merupakan molekul DNA sirkuler yang terdapat dalam bakteri dan berbagai organisme lain. Plasmid dapat melakukan replikasi dengan tidak tergantung pada kromosom sel tuan rumah.
2. Kromosom virus, terutama bakteriofag, yaitu virus yang harus menginfeksi bakteri pada waktu infeksi molekul DNA bakteriofag diinfeksikan ke dalam sel tuan rumah dan kemudian DNA mengalami replikasi.
Molekul DNA plasmid dan bacteriofag mempunyai sifat-sifat dasar yang ditentukan sebagai wahana kloning, namun sifat ini tidak berguna tanpa adanya teknik-teknik eksperimen untuk manipulasi molekul DNA di dalam laboratorium. Ketrampilan dasar untuk melalukan kloning secara sederhana adalah:
1. Preparasi sampel DNA murni
2. Pemotongan DNA murni
3. Analisis ukuran fragmen DNA
4. Penggolongan molekul DNA
5. Memasukkan molekul DNA ke dalam sel tuan rumah
6. Identifikasi sel yang mengandung molekul DNA rekombinan

Adapun teknik-teknik kloning gen yang umum dilakukan adalah sebagai berikut:

Kloning Gen Eukariotik dalam Plasmid Bakteri
Pengekspresian gen eukariot di dalam ruang lingkup gen prokariot sangatlah sulit, karena kedua gen tersebut susunannya berbeda, selain itu adanya daerah bukan pengkode (intron) di dalam DNA eukariotik yang cukup panjang dapat mencegah ekspresi gen yang benar oleh sel prokariot. Untuk mengatasi hal tersebut, maka ketika enzim restriksi memotong DNA eukariot, di bagian hulu fragmen DNA tersebut harus disisipi oleh promoter prokariot. Pada saat gen eukariot disisipkan, bakteri dapat mengenali promoter, dan langsung mengekspresikan gen tersebut. Untuk hal yang kedua, bisa diatasi dengan merubah mRNA menjadi DNA komplementer (complementary DNA/cDNA) menggunakan enzim transcriptase balik (reverse transcriptase), yaitu enzim yang diisolasi dari retrovirus. mRNA bisa digunakan karena pada mRNA, intronnya telah dikeluarkan pada saat proses splicing.
Setelah DNA ditransplantasi menghasilkan DNA rekombinan, maka DNA tersebut harus dimasukkan kembali ke dalam inang supaya dapat berekspresi. Pemasukan DNA rekombinan bisa dengan cara elektroporasi (memberikan kejutan listrik untuk membuka membran sel) atau dengan cara penyuntikan (mikroinjeksi) atau dengan cara transformasi, yaitu penyerapan DNA rekombinan dari larutan.

Kloning DNA secara in vitro
Pengklonan DNA di dalam sel tetap merupakan metode terbaik untuk mempersiapkan gen tertentu dalam jumlah banyak. Namun ketika sumber DNA sangat sedikit dan tidak murni, maka dapat digunakan metode PCR (Polymerase Chain Reaction), sehingga setiap fragmen DNA dapat disalin beberapa kali dengan cepat dan diperkuat (amplifikasi) tanpa menggunakan sel. Adapun yang dibutuhkan dalam PCR adalah enzim DNA polymerase yang tahan panas, potongan DNA untai tunggal sebagai primer dan pasokan nukleotida.
Sejak tahun 1985, PCR telah banyak digunakan dalam penelitian biologis kedokteran, sosial dan hukum. Contohnya: PCR digunakan untuk memperkuat DNA gajah purba (Mammoth) yang telah berusia 40.000 tahun, PCR digunakan untuk mendeteksi pelaku kejahatan dari sampel DNA air mani, darah atau jaringan tubuh pelaku lainnya atau PCR ini digunakan untuk mendeteksi patogen yang sulit terdeteksi seperti DNA virus HIV.