Spiga

Selamat Tinggal Kedelai Impor

Krisis kedelai sebagai bahan baku tahu, tempe dan kecap menjadi masalah nasional karena ternyata 60% lebih masih diimpor dan harganya semakin melambung. Pusat Penelitian dan Pengembangan Biotek LIPI yang berdiri pada tahun 1986 memiliki riset yang salah satunya difokuskan pada upaya memacu produktivitas kedelai yang ada. Caranya dengan mencari mikroba yang dapat memacu pertumbuhan kedelai. Produksinya dapat dimanfaatkan untuk mendukung program ketahanan pangan. Penelitian ini, jelas Endang Sukara, Deputi Ilmu Pengetahuan Hayati LIPI, telah menemukan isolat Rhizobium BTCC-B64 sebagai satu dari ratusan koleksi isolat terseleksi yang punya keistimewaan karena mampu bersimbiosis secara efektif dengan banyak galur kedelai, kacang hijau dan sengon.

Peneliti mikroba tanah pada Puslit Bioteknologi LIPI, Harmastini Sukiman, M. Agr, menjelaskan cara kerjanya adalah dengan menginjeksikan Rhizobium BTCC-B64 ke dalam biji kedelai pada tekanan 1 atm. Rhizobium BTCC-B64 bertahan hidup dan memperbanyak diri pada tingkat keasaman yang sangat rendah (pH 2), dapat membentuk bintil akar pada kondisi asam (pH 3), dapat meningkatkan nitrogen tanah sampai 20% setelah penanaman dan tidak memerlukan pupuk sama sekali.
Dari uji tebaran di Musi Rawas untuk 1 ha lahan menggunakan benih kedelai plus dapat diperoleh hasil panen 3,6 ton yang sebelumnya menggunakan benih kedelai biasa hasil panennya 1,4 ton per ha. Adapun keuntungan kedelai plus lainnya adalah mudah diaplikasikan oleh petani, mikroba yang diinsersikan mampu tumbuh dan bersimbiosis pada lahan asam (pH 2-4). Puslit bioteknologi LIPI juga mengembangkan inovasi pupuk berbasis mikroba yaitu VA-Mikorisa. Pupuk ini menggunakan inokulum penumbuh mikroba di dalam media tanah yang mempunyai kemampuan sebagai penambat phosphat, meningkatkan pertumbuhan hormon, hara dan mineral.
Manfaat pupuk memacu pertumbuhan benih, mempersingkat waktu persemaian dan ketahanan terhadap stress, air dan serangan penyakit akar, mengurangi biaya pemeliharaan dan ramah lingkungan.
Kepala puslit bioteknologi LIPI, Prof. Dr. Ir. Bambang Prasetya, mengungkapkan bahwa perkembangan lebih lanjut dilakukan dengan menjalin kerja sama dengan pihak swasta dengan melakukan percobaan skala lapangan di Cicadas, Bogor. Selain itu juga akan dilakukan penanaman dalam skala besar, antara lain sedang dijajaki di Sulawesi Tenggara, sudah saatnya Indonesia mengurangi ketergantungan pada kedelai impor dengan memberi peluang dan kemudahan bagi petani untuk mengembangkan sumber daya lokal. Hal ini memerlukan dukungan kebijakan pemerintah untuk mendorong produksi benih unggul oleh lembaga riset. Selanjutnya, mendistribusikan ke petani secara gratis sehingga petani terdorong menggunakan produk lokal.

(Sumber: MEDIA BIOTEK Vol 1, No 1 Maret 2008)



Readmore »»

Biohidrogen Sebagai Bahan Bakar Masa Depan

Krisis energi dunia yang akhir-akhir ini melanda seluruh negeri telah membangkitkan keyakinan bahwa bioenergi merupakan alternatif pemecahan hal tersebut. Sementara harga minyak bumi yang melambung belakangan ini dengan sendirinya membangkitkan insentif ekonomi bagi pengembangan bioenergi sebagai alternatif lain dari fosil energi yang kian mahal dan langka. Insentif itu juga timbul karena semakin besarnya perhatian negara-negara dunia pada persoalan lingkungan hidup akibat pencemaran yang kian parah, yang timbul dari emisi gas buang penggunaan fosil energi. Keunggulan bioenergi yang utama adalah renewable dan dampak penggunaannya terhadap lingkungan jauh lebih ramah dari penggunaan fosil energi selama ini.

Produksi energi hidrogen diperoleh secara alami maupun buatan (proses kimia, fisika dan biologi). Indonesia merupakan salah satu negara yang sedang menghadapi persolan energi yang serius akibat ketergantungan yang sangat besar terhadap energi fosil. Bersyukurlah akhir-akhir ini berbagai penelitian telah membuahkan hasil, antara lain biohidrogen. Salah satunya adalah penelitian yang dilakukan oleh Dr. Dwi Susilaningsih, M.Pharm. Topik penelitiannya adalah produksi bioenergi gas hidrogen dari biomassa limbah pertanian. Penelitian ini sudah dilakukan selama 3 tahun di Puslit Bioteknologi LIPI, dari mulai tahun 2006 sampai sekarang. Biohidrogen merupakan salah satu prioritas utama program riset unggulan RISTEK.
Biohidrogen merupakan energi baru dan terbarukan yang diharapkan dapat menjawab keterbatasan energi fosil. Pemanfaatan limbah pertanian ini dapat meningkatkan fungsi dari limbah yang biasanya hanya dianggap sampah.
Biohidrogen dapat dihasilkan dari limbah pertanian melalui proses bioteknologi yaitu fermentasi. Metode ini merupakan perpaduan antara pendekatan secara kimiawi dan biologi. Secara biologi limbah pertanian yang menjadi bahan baku pembuatan hidrokarbon ini didegradasi menggunakan berbagai jenis jamur. Sedangkan secara kimiawi menggunakan asam kuat dari mulai yang pekat sampai yang telah diencerkan.
Biohidrogen sebagai produk utama dari proses fermentasi itu menjadi salah satu jawaban atas terbatasnya sumber energi fosil. Di masa yang akan datang biohidrogen, sebagaimana bioetanol dan biodiesel dimungkinkan menjadi bahan bakar yang banyak digunakan oleh industri. Keistimewaan yang ada pada biohidrogen adalah bahwa biohidrogen mudah dikonversi menjadi fuel atau listrik tanpa menyisakan polutan. Melimpahnya biomassa dari limbah dan non limbah di Indonesia merupakan penunjang ketersediaan substrat dalam jangka waktu yang panjang serta merupakan sumber energi baru dan dapat diperbaharui. Di masa mendatang akan kita temukan berbagai pemanfaatan bioenergi sebagai bahan bakar pengganti dari energi fosil yang tidak dapat diperbaharui.



Readmore »»

Bioenergi dan Pembangunan Daerah

Belakangan ini harga minyak dunia naik tajam, oleh karena itu sudah waktunya dilakukan peningkatan penggunaan sumber energi alternatif. Energi alternatif yang dicari adalah energi yang terbarukan, yaitu biofuel atau atau bioenergi, sumber energi yang berasal dari bahan bakar nabati. Untuk itulah Kebijakan Energi Nasional dikeluarkan pemerintah dalam Perpres No 5 Tahun 2006. Indonesia mentargetkan BBN (Bahan Bakar Nabati) mengganti 10% konsumsi bahan bakar konvensional pada tahun 2010. Perluasan areal penanaman bahan baku energi alternatif ini dapat menggunakan lahan kritis.
Dikenal beberapa jenis BBN cair antara lain biodiesel dan bioethanol. Biodiesel dipakai sebagai pengganti minyak solar, sedangkan bioethanol dipakai sebagai pengganti bensin. Biodiesel antara lain dibuat dari minyak sawit dan minyak jarak, sedangkan bioethanol dari tumbuhan yang mempunyai gula dan pati. Sehubungan dengan kebijakan AS dan Eropa menjadikan BBN maka permintaan jagung dan kedelai naik sehingga harga pun melonjak. Hal ini perlu mendapat perhatian serius dari semua pihak.


Para peneliti diharapkan dapat menciptakan teknologi yang dapat membantu menyelesaikannya. Untuk itu limbah pertanian menjadi sumber yang menjanjikan. Limbah pertanian kebanyakan diperoleh dari sisa hasil olahan produk. Perkembangan agroindustri di Indonesia telah menimbulkan peningkatan jumlah limbah pertanian.
Konon algae juga penghasil minyak yang dapat digunakan sebagai biodiesel. Diperkirakan algae pada kondisi terbaiknya mampu menghasilkan minyak 200 kali lebih banyak dibandingkan kelapa sawit. Budidaya algae biasanya dilakukan dalam kolam yang dangkal agar algae tetap dapat memperoleh sinar matahari, kemudian CO2 dari hasil proses bioethanol dialirkan di dalamnya. Selanjutnya, proses ekstraksi minyak dari algae dilakukan dengan pelarut heksan.
Pemanfaatan bioethanol tidak hanya untuk energi transportasi, tetapi dapat pula digunakan sebagai bahan bakar keluarga pengganti minyak tanah. Cara seperti ini bisa menjadi alternatif kelangkaan minyak tanah di pedesaan. Ternyata dengan pemanfaatan limbah pertanian dan pemanfaatan algae dapat mencukupi kebutuhan akan sumber bahan bakar.
Lapangan Kerja
Pengembangan bioenergi dapat menyerap tenaga kerja baru. Dengan pengembangan bioenergi menjadi sarana untuk membuka lapangan pekerjaan, terutama pada daerah-daerah transmigrasi sehingga sekaligus dapat mengurangi angka urbanisasi. Pada akhirnya, diharapkan akan didapatkan kesejahteraan yang merata dan mengurangi angka kemiskinan.
Perusahaan pertanian di daerah biasanya memprogramkan CSR sebagai kepanjangan dari Coorporate Social Responsibility. Program ini antara lain diarahkan untuk pemberdayaan masyarakat di sekitar perusahaan untuk mengatasi kemiskinan.
Kesuksesan program ini antara lain dengan adanya “Desa Mandiri Energi”. Desa Mandiri Energi adalah desa yang dapat memproduksi sendiri kebutuhan energinya dan tidak lagi bergantung dari pihak yang lain.
Program ini dianggap mampu mengatasi kemiskinan, menciptakan lapangan kerja dan menyelamatkan lahan kritis menjadi lahan produktif.

Sumber: Media Biotek



Readmore »»

Awet Muda dengan Sari Kedelai

Sari kedelai mengandung senyawa lisetin yang berfungsi sebagai penghancur lemak sehingga dapat membuat kita menjadi lebih awet muda. Lisetin dapat mendorong regenerasi sel agar tubuh menjadi bugar. Selain itu, percobaan pada hewan terbukti dapat meningkatkan umur harapan hidupnya sampai 36%.
Senyawa ini merupakan senyawa phosphatidyl choline yang umumnya ditemukan pada selaput sel tumbuhan dan hewan, serta dalam jaringan urat syaraf dan otak manusia. Choline (sebagai bagian terbesar dari phosphatydil choline dapat ditemukan di dalam hati, oatmeal, kubis dan kembang kol. Lesistin terdapat juga pada bungan matahari, lobak dan kedelai.


Di dalam kedelai terkandung 20%-22% lisetin dapat mendorong pengangkutan asam lemak dari hati ke jaringan tubuh (lipotropik) dan dapat meningkatkan pembakaran lemak di hati. Di dalam tubuh, senyawa lesitin akan bekerja mengikis timbunan lemak pada dinding pembuluh nadi yang kemudian larut dalam lemak.
Kemampuan lesitin untuk mengurangi lemak disebabkan karena adanya kandungan asam lemak tak jeuh seperti asam lemak linoleat atau omega 6 (sekitar 55%), asam oleat (9,8%) dan asam arakhidonat (5,5%). Molekul asam lemak tak jenuh tersebut berikatan rangkap dan akan mengikat molekul lemak lainnya. Sesudah berikatan dengan lemak lainnya, kemudian akan dibakar di tempat-tempat yang memerlukannya di dalam tubuh sebagai energi. Lesitin diduga dapat juga mencegah terjadinya penyakit jantung koroner, stroke, dan domensia (penurunan daya ingat karena terhambatnya pasokan oksigen ke otak akibat pembuluh darah yang tersumbat) pada penderita hipertensi dan diabetes. Bagi penderita pasca stroke, pasca by pass dan perlemakan hati, lesitin dapat membantu menjaga kondisinya agar pembuluh darah tidak lagi tersumbat. Namun, mengapa lesitin sering disebut sebagai obat awet muda? Pada mereka yang hatinya banyak mengandung lemak, biasanya pertukaran zat di dalam tubuhnya tidak normal. Itu disebabkan karena hati (yang sebenarnya memecah lemak dan menetralkan racun) tidak berfungsi dengan baik. Tubuh menjadi payah dan wajah akan tampak tua. Dengan adanya lesitin, kelebihan lemak pada hati akan dikurangi. Kerjanya akan normal kembali sehingga tubuh akan kembali segar atau terasa lebih awet muda.

Sumber: mediastore.com



Readmore »»

Produk Rekayasa Genetika

Produk Rekayasa genetika (PRG) diartikan sebagai suatu organisme yang memiliki material genetik yang diperoleh dari teknik rekayasa genetika. Prinsip umum dalam menghasilkan PRG dilakukan dengan mengintroduksi material genetika baru ke dalam genom individu. Teknologi rekayasa genetika secara konservatif telah dilakukan seiring dengan perkembangan cabang ilmu genetika melalui proses perkawinan silang untuk mendapatkan bibit unggul. Perkembangan rekayasa modern dilakukan dengan proses yang lebih cepat melalui rekombinan secara in vitro (di luar sel makhluk hidup) sehingga memungkinkan mencangkok (kloning) hanya satu jenis gen yang diinginkan dalam waktu yang lebih cepat).

Produk Rekayasa genetika (PRG) diartikan sebagai suatu organisme yang memiliki material genetik yang diperoleh dari teknik rekayasa genetika. Prinsip umum dalam menghasilkan PRG dilakukan dengan mengintroduksi material genetika baru ke dalam genom individu. Teknologi rekayasa genetika secara konservatif telah dilakukan seiring dengan perkembangan cabang ilmu genetika melalui proses perkawinan silang untuk mendapatkan bibit unggul. Perkembangan rekayasa modern dilakukan dengan proses yang lebih cepat melalui rekombinan secara in vitro (di luar sel makhluk hidup) sehingga memungkinkan mencangkok (kloning) hanya satu jenis gen yang diinginkan dalam waktu yang lebih cepat). Isu yang berkembang di masyarakat menyebutkan bahwa produk rekayasa genetika (PRG) merupakan produk yang berbahaya bagi kesehatan. Apakah hal itu benar? WHO dalam situsnya menyatakan bahwa semua produk yang terdapat di pasar internasional telah melalui uji resiko yang dilakukan masing-masing oleh lembaga yang berwenang. Dari pernyataan ini, apabila pengujian ini memang dilakukan dengan objektif dan prosedur yang benar, maka seharusnya tidak ada resiko kesehatan dan lingkungan dari PRG. Lalu bagaimanakan dengan regulasi peraturan dari pemerintah Indonesia mengenail PRG? Mengenai PRG sendiri di Indonesia diatur dalam UU Nomor 7 tentang Pangan yang memperbolehkan penggunaan produk pangan transgenik. UU diperkuat dengan PP No. 69/1999 tentang label dan iklan pangan dan PP No. 28/2004 tentang keamanan mutu dan gizi pangan yang menjelaskan mengenai definisi, pemeriksaan keamanan, serta persyaratan dan tata cara pemeriksaan pangan produk rekayasa genetika. Dalam PP No. 69/1999 pasal 35 disebutkan bahwa pada label untuk pangan rekayasa genetika wajib dicantumkan tulisan PANGAN REKAYASA GENETIK. Dalam ayat berikutnya disebutkan bahwa dalam hal pangan hasil rekayasa genetika merupakan bahan yang digunakan dalam suatu produk pangan, pada label cukup dicantumkan keterangan tentang pangan rekayasa genetika pada bahan yang merupakan pangan hasil rekayasa genetika tersebut saja. Meskipun demikian YLKI meminta pengaturan mengenai ambang batas kandungan maksimum bahan rekayasa genetika yang terdapat dalam satu produk. Hasil pengujian YLKI menunjukkan adanya beberapa produk yang disebut positif mengandung rekayasa genetika, antara lain:
1. Tahu pong halus “Poo” produksi Sari Lezat
2. Tofu Jepun produksi Kong Kee Food
3. Tempe murni Super Djimmy
4. Susu kedelai coklat merk Sarinah
5. Susu kedelai Ohayo produksi Harum Sari Food
6. Susu formula Nutrilon Soya produksi Nutricia
7. Corn Flakes Petaled De Mais produksi Pacifik Food
8. Keripik kentang Pringleys produksi P&G
9. Tepung jagung/Maizena merk Honig
Terkait dengan isu PRG, dalam situs inilah.com, Departemen Pertanian hingga saat ini belum mengeluarkan PRG secara komersial ke petani. Padahal beberapa penelitian bioteknologi telah dilakukan melalui Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian (Litbangtan). Kepala Badan Litbang Deptan, Achmad Suryana menyatakan hal itu disebabkan berbagai kelemahan dan kesempatan yang dimiliki baik sumber daya manusia, dana, fasilitas dan peraturan. Pada saat ini belum satupun tanaman produk rekayasa genetika produksi dalam negeri yang telah dikeluarkan secara komersial untuk petani. Namun demikian, menurut dia, pemerintah menaruh harapan besar terhadap hasil penelitian bioteknologi agar berperan dalam mencapai swasembada pangan.
Sebenarnya ada dua varietas tanaman padi yang dihasilkan oleh Badan Litbang, yaitu varietas Code dan Angke. Kedua varietas itu tahan terhadap penyakit hawar daun dan saat ini telah memberikan manfaat kepada petani di daerah endemic penyakit hawar daun bakteri. Kedua varietas tersebut dapat secara cepat dilepas ke petani karena proses pembuatannya tidak menggunakan proses rekayasa genetika, sehingga dalam pelepasannya tidak harus melalui pengkajian keamanan hayati dan keamanan pangan.
Saat ini, Balai Besar Penelitian Bioteknologi, Badan Litbang Pertanian telah mendapatkan beberapa kandidat tanaman transgenik yang memiliki sifat baik dan dapat dikembangkan lebih lanjut serta dimanfaatkan petani. Selain itu, Puslit Bioteknologi LIPI dengan beberapa Kelti telah mengembangkan penelitian untuk menghasilkan tanaman transgenik padi yang telah sampai pada tahap uji lapangan.



Readmore »»

Predicting protein function from protein/protein interaction data

Motivation: The development of experimental methods for genome scale analysis of molecular interaction networks has made possible new approaches to inferring protein function. This paper describes a method of assigning functions based on a probabilistic analysis of graph neighborhoods in a protein-protein interaction network. The method exploits the fact that graph neighbors are more likely to share functions than nodes which are not neighbors. A binomial model of local neighbor function labeling probability is combined with a Markov random field propagation algorithm to assign function probabilities for proteins in the network. Results: We applied the method to a protein-protein interaction dataset for the yeast Saccharomyces cerevisiae using the Gene Ontology (GO) terms as function labels. The method reconstructed known GO term assignments with high precision, and produced putative GO assignments to 320 proteins that currently lack GO annotation, which represents about 10% of the unlabeled proteins in S. cerevisiae.

Download Complete PDF


Readmore »»

High-level Expression of Cecropin X in Escherichia coli

Cecropin X is a short cationic peptide with a broad antibacterial and antitumor spectrum. Here, we report the production of a tumor necrosis factor (TNFα)-cecropin X fusion protein under the control of a temperature-inducible PR promoter in the bacterial expression vector pRC. During fermentation, we studied and optimized essential parameters including the type of host cells, medium, timing of induction, post-induction time and dissolved oxygen level. Using the suitable conditions in the fermentation, up to 20 % - 23 % of the total cellular proteins is produced as the fusion protein, mostly in the form of inclusion bodies. After washing, on average about 5.27 g dried inclusion bodies could be collected from 1 L broth and the purity of inclusion bodies reached 80 %. Cecropin X obtained by cleaving the fusion protein with cyanogen bromide showed remarkable tumorcidal activity against mouse Lewis lung carcinoma 3LL in vivo.

Download Complete PDF


Readmore »»

High efficiency transformation of E.coli by high voltage electroporation

E. coil can be transformed to extremely high efficiencies by subjecting a mixture of cells and DNA to brief but intense electrical fields of exponential decay waveform (electroporation). We have obtained 109 to 1010 transformants/jg with strains LE392 and DH5ox, and plasmids pUC18 and pBR329. The process is highly dependent on two characterstics of the electrical pulse: the electric field strength and the pulse length (RC time constant). The frequency of transformation is a linear function of the DNA concentration over at least six orders of magnitude; and the efficiency of transformation is a function of the cell concentration. Most of the surviving cells are competent with up to 80% transformed at high DNA concentration. The mechanism does not appear to include binding of the DNA to the cells prior to entry. Possible mechanisms are discussed and a simple procedure for the practical use of this technique is presented.

Download Complete PDF


Readmore »»

Concerted Binding and Bending of DNA

Integration host factor (IHF) is a heterodimeric Eschericia coli protein that plays essential roles in a variety of cellular processes including site specific recombination, transcription, and DNA replication. The IHFDNA interface extends over three helical turns and includes sequential minor groove contacts that present strong, sequence specific protection patterns against hydroxyl radical cleavage. Synchrotron X-ray footprinting has been used to follow the kinetics of formation of DNA-protein contacts in the IHF-DNA complex with single base-pair spatial, and millisecond time, resolution. The three sites of IHF protection on the DNA develop with similar time-dependence, indicating that sequence specific binding and bending occur concertedly. Two distinct phases are observed in the association process. The first ``burst'' phase is characterized by a rate that is greater than diffusion limited (>1010 sÿ1 Mÿ1) and the second phase is on the order of diffusion controlled (_108 Mÿ1 sÿ1). The overall kinetics of association become faster with increasing IHF concentration showing that complex formation is second-order with protein. The rate of association is maximal between 100 and 200 mM KCl decreasing at higher and lower concentrations. The rate of IHF dissociation from site specifically bound DNA increases monotonically as KCl concentration is increased. The dissociation progress curves are biphasic with the amplitude of the first phase dependent upon competitor DNA concentration. These results are the first analysis by synchrotron footprinting of the fast kinetics of a protein-DNA interaction and suggest that IHF binds its specific site through a multiple-step mechanism in which the first step is facilitated diffusion along the length of the duplex followed by subsequent binding and bending of the DNA in a concerted manner.

Download Complete PDF


Readmore »»

Cloning and Expression of Coxsakievirus B3 Viral Protein-1

Background: Viral protein-1 (VP1) is a major capsid protein of Coxsakievirus B3 (CVB3) that plays an important role in directing viruses towards permissive cells and acts as a main antigenic site of the virus in eliciting of host immune response, hence it seems VP1 can be considered as a vaccine candidate against CVB3 infection. In this study, cDNA of VP1 was prepared, cloned into pET expression vector and the recombinant protein (VP1) was over expressed in E. coli. Methods: The viruses were grown in suspension cultures of Vero cells with an input virus multiplicity of 10-50 plaque-forming units/cell. After observing complete cytopathic effect, the total RNA (cells and virus) was prepared for RT-PCR and by using specific primers, VP1 cDNA was amplified and ligated into pET vectors (32 a and 28 a). The recombinant vector was transferred into competent E. coli (BL-21) and after selection of proper colony, which carried correct cDNA within the vector; cells were cultured and induced with isopropyl B-D-thiogalactopyranoside, in order to express protein (VP1). The cultures were tested for presence of VP1 by SDS-PAGE and Western-Blotting analysis. Results: Molecular techniques such as PCR which showed exact defined size of the VP1 (819 bp), restriction digestion and finally immunoblot analysis of over expressed protein; all confirmed the correct cloning and expression of VP1 in this research. Conclusion: In this research, full length of VP1 as major capsid protein of CVB3 was over expressed in E. coli which, can be used for further studies, including neutralizing antibody production against CVB3.

Download Complete PDF


Readmore »»

CLONING, EXPRESSION AND PURIFICATION OF THE GENERAL STRESS PROTEIN YhbO FROM Escherichia coli

We cloned, expressed and purified the Escherichia coli yhbO gene product, which is homolog to the Bacillus subtilis general stress protein 18 (the yfkM gene product), the Pyrococcus furiosus intracellular protease PfpI, and the human Parkinson disease protein DJ-1. The gene coding for YhbO was generated by amplifying the yhbO gene from E. coli by polymerase chain reaction. It was inserted in the expression plasmid pET-21a, under the transcriptional control of the bacteriophage T7 promoter and lac operator. A BL21(DE3) E. coli strain transformed with the YhbO-expression vector pET-21a-yhbO, accumulates large amounts of a soluble protein of 20 kDa in SDS-PAGE that matches the expected YhbO molecular weight. YhbO was purified to homogeneity by HPLC DEAE ion exchange chromatography and hydroxylapatite chromatography and its identity was confirmed by N-terminal sequencing and mass spectrometry analysis. The native protein exists in monomeric, trimeric and hexameric forms.

Download Complete PDF


Readmore »»

Expression of green fluorescent protein (GFPuv) in Escherichia coli DH5-α, under different growth conditions

The recombinant green fluorescent protein (GFPuv) was expressed by transformed cells of Escherichia coli DH5-α grown in LB/amp broth at 37oC, for 8 h and 24 h. To evaluate the effectiveness of different parameters to improve the expression of GFPuv by E. coli, four variable culturing conditions were set up for assays by a fractional factorial (24-1) design at two levels: (i) the effect of storing (24-48 h) the seeded broth at 4oC prior to incubation at 37oC; (ii) the effect of agitation speed (100-200 rpm); (iii) the final concentration (0.05-0.5 mM) of IPTG (isopropyl–β-D-thiogalactopyranoside) and (iv) the addition of IPTG at set cell densities (OD660 0.01-0.8). GFPuv was extracted from cells by the three phase partitioning method (TPP) and further purified with a methyl HIC column. The cultures grown at 37oC/24 h provided the highest yields of GFPuv under the conditions: (i) pre-storage at 4oC/24 h; (ii) agitation speed at 100 rpm; (iii) 0.5 mM IPTG and (iv) IPTG addition at OD660~0.01. On the other hand, at 37oC/ 8 h, GFPuv expression was dependent upon agitation of broth cultures at 200 rpm and the IPTG addition at the beginning of the growth exponential phase.



Readmore »»

Cloning and Characterization of the Zymobacter palmae Pyruvate Decarboxylase Gene (pdc) and Comparison to Bacterial Homologues

Pyruvate decarboxylase (PDC) is the key enzyme in all homo-ethanol fermentations. Although widely distributed among plants, yeasts, and fungi, PDC is absent in animals and rare in bacteria (established for only three organisms). Genes encoding the three known bacterial pdc genes have been previously described and expressed as active recombinant proteins. The pdc gene from Zymomonas mobilis has been used to engineer ethanol-producing biocatalysts for use in industry. In this paper, we describe a new bacterial pdc gene from Zymobacter palmae. The pattern of codon usage for this gene appears quite similar to that for Escherichia coli genes. In E. coli recombinants, the Z. palmae PDC represented approximately 1/3 of the soluble protein.
Biochemical and kinetic properties of the Z. palmae enzyme were compared to purified PDCs from three other bacteria. Of the four bacterial PDCs, the Z. palmae enzyme exhibited the highest specific activity (130 U mg of protein_1) and the lowest Km for pyruvate (0.24 mM). Differences in biochemical properties, thermal stability, and codon usage may offer unique advantages for the development of new biocatalysts for fuel ethanol production.


Download Complete PDF

Readmore »»

Cloning, sequencing, expression, and antigenic characterization of rMSP4 from Anaplasma marginale isolated from Paraná State, Brazil

Anaplasmosis is a bovine intraerythrocytic disease caused by the bacterium Anaplasma marginale; it causes significant economic losses in tropical and subtropical regions, worldwide. The msp4 gene of an A. marginale strain isolated in Paraná, Brazil, was amplified by PCR and sequenced; its cloning into the pET102/D-TOPO® vector produced an msp4-6xHis-V5-HP thioredoxin fusion gene construct. This recombinant clone was over-expressed in Escherichia coli BL21(DE-3); the expressed fusion protein was found almost entirely in the insoluble form (inclusion bodies) in the cell lysate. The inclusion bodies were solubilized with urea and the recombinant protein was purified by Ni-NTA column and dialyzed. This method produced a relatively high yield of rMSP4, which was used to immunize rabbits. The deduced amino acid sequence encoded by MSP4 showed 99% homology to A. marginale isolates from Florida, USA, and from Minas Gerais, Brazil. Both rMSP4 and native MSP4 were recognized by post-immunization rabbit serum, showing that rMSP4 has conserved epitopes. As antigenicity was preserved, rMSP4 might be useful for the development of vaccine against anaplasmosis.

Download Complete PDF


Readmore »»

Genetic Engineering of Zymobacter palmae for Ethanol Production from Xylose

Its metabolic characteristics suggest Zymobacter palmae gen. Nov., sp. Nov. could serve as a useful new ethanol-fermenting bacterium, but its biotechnological exploitation will require certain genetic modifications. We therefore engineered Z. palmae so as to broaden the range of its fermentable sugar substrates to include the pentose sugar xylose. The Escherichia coli genes encoding the xylose catabolic enzymes xylose isomerase (XI), xylulokinase (XK), transaldolase (TA) and transketolase (TK) were introduced into Zb. palmae, where their expression was driven
by the Zymomonas mobilis glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAP) promoter. When cultured with 40 g/l xylose, the recombinant Z. palmae was able to ferment 16.4 g/l xylose within 5 days, producing 91% of the theoretical yield of ethanol with no accumulation of organic acids as metabolic by-products. Notably, xylose-acclimation enhanced both the expression of xylose catabolic enzymes and the rate of xylose uptake into recombinant Z. palmae, which enabled the acclimated organism to completely and simultaneously ferment a mixture of 40 g/l glucose and 40 g/l xylose within 8 h, producing 95% of theoretical yield of ethanol. Thus, efficient fermentation of a mixture of glucose and xylose to ethanol can be accomplished using Z. palmae expressing E. coli xylose catabolic enzymes.

Download Complete PDF


Readmore »»

HUMAN GENOME PROJECT

Human Genome Project (HGP) resmi dimulai pada bulan Oktober 1990. Tujuannya adalah untuk menentukan urutan lengkap dari 3 miliar subunit DNA, mengidentifikasi seluruh gen manusia, membuatnya dapat diakses lebih jauh untuk kepentingan penelitian biologi dan mempelajari berbagai dampak sosial, etis bahkan dampak politis yang timbul dari pemetaan yang dilakukan. Sebelumnya para peneliti juga telah memetakan kode genetik dari 24 spesies dari jenis virus sampai bakteri, tanaman dan serangga, dan kini manusia. Hasilnya memperlihatkan bahwa semua organisme disatukan oleh satu kode genetik yang berlaku umum.

Proyek ini adalah sebuah kerja raksasa karena sekitar 3,5 milyar huruf dalam genom manusia harus dibaca. Jika diandaikan sebuah buku dan kecepatan rata-rata orang membaca sepuluh huruf adalah satu detik, maka buku itu akan selesai dibaca dalam sepuluh tahun (tanpa henti) dengan perhitungan bahwa kecepatan sepuluh huruf per detik sama dengan 600 huruf per menit, 36.000 huruf per jam, 864.000 huruf per hari dan 315.360.000 basa per tahun.
Awalnya, proyek ini direncanakan selesai dalam 15 tahun. Akan tetapi, perkembangan teknologi yang pesat membuat proyek ini selesai lebih cepat dari yang direncanakan. Draft pertama selesai pada Juni 2000 dan hasil akhir yang berupa genom manusia yang sempurna selesai seluruhnya pada tahun 2003.
Selama 13 tahun tersebut proyek ini berjalan di bawah koordinasi Departemen Energi Amerika Serikat dan Institut Kesehatan Nasional. Lebih dari 15 negara terlibat dalam proyek ini yaitu diantaranya Australia, Brazil, Kanada, China, Denmark, Perancis, Jerman, Israel, Italia, Jepang, Korea, Meksiko, Belanda, Rusia, Swedia, dan Inggris. Inilah upaya ilmiah terorganisasi terpenting yang pernah ada.

Readmore »»

Kamus Istilah Biomolekuler

Artikel berikut menanggapi saran dan masukan dari beberapa pembaca yang menginginkan agar dimasukkan tulisan semacam kamus atau kosakata tentang biomolekuler untuk mempermudah pemahaman bagi pembaca yang masih awam

Adenin :salah satu jenis basa purin yang terdapat pada DNA dan RNA.
Antikodon :tiga basa berurutan pada tRNA yang komplementer terhadap tiga basa berurutan yang berperan sebagai kodon pada mRNA.
Asam Amino :senyawa organik yang mengandung gugus amino (NH2) dan gugus karboksil (COOH). Asam amino merupakan satuan penyusun (building block) protein. Asam amino yang umum diantaranya adalah alanin, prolin, treonin, histidin, lisin, glutamin, fenilalanin, triptofan, arginin, tirosin, leusin.
Asam Nukleat :makromolekul yang mengandung gula pentosa, fosfat dan basa organik (basa nitrogen). Makromolekul yang merupakan rangkaian nukleotida (rangkaian nukleotida = polinukleotida). DNA dan RNA adalah asam nukleat.
Diploid :organisme atau sel yang mempunyai 2 set kromosom (2n) atau 2 genom. Jaringan somatik pada sebagian besar tumbuhan tingkat tinggi dan pada hewan mempunyai 2 set kromosom.
DNA Rekombinan :kombinasi DNA yang tidak ada sebelumnya. Kombinasi DNA yang berasal dari sumber yang berbeda-beda. Gabungan dari dua atau lebih molekul DNA yang masing-masing berasal dari sumber yang berbeda.
DNA :Deoxyrobo Nucleic Acid atau asam deoksorobo nukleat. Bahan genetik yang mengandung gen-gen.
Eksonuklease :enzim yang menghancurkan atau memotong utas DNA atau RNA mulai dari posisi ujung.
Elektroforesis : teknik yang umum digunakan untuk analisis DNA dan protein. suatu teknik pemisahan senyawa yang bermuatan dengan meletakkannya pada suatu medan listrik.
Endonuklease :enzim yang memotong utas DNA pada posisi internal (bagian dalam).
Enzim Restriksi :enzim endonuklease yang mengenal sekuen pendek yang spesifik pada DNA dan memotong DNA.
Enzim :protein yang mempercepat reaksi kimia spesifik di dalam sistem kehidupan.
Gen Regulator :sebuah gen yang mengontrol laju ekspresi sebuah atau gen-gen lainnya. Contoh: gen lac I menghasilkan protein yang mengontrol ekspresi gen-gen structural yang terdapat di dalam operon lac pada bakteri E. coli.
Gen :faktor yang menentukan fungsi atau sifat biologis yang spesifik. Unit yang diwariskan yang terletak pada posisi tetap dalam kromosom.
Genetika :ilmu tentang pewarisan sifat dan variasi (keragaman) makhluk hidup.
Genom :satu set kromosom lengkap (n) yang diwariskan sebagai satu kesatuan dari satu tetua.
Heliks :struktur yang berbentuk spiral. DNA menurut model dari Watson dan Crick adalah berbentuk heliks ganda (dua heliks).
Hibrid :keturunan atau hasil perkawinan antara tetua-tetua homozigot yang berbeda dalam hal satu atau beberapa gennya. Umumnya, hibrid adalah keturunan atau hasil perkawinan dari dua varietas atau galur atau strain yang berbeda.
Histon :kelompok protein yang berasosiasi dengan DNA, berfungsi dalam penggulungan DNA di dalam kromosom dan berperan di dalam regulasi aktivitas gen.
Inducer :senyawa berbobot rendah yang menginaktifkan repressor dengan cara berkombinasi dengannya sehingga menstimulir ekspresi gen.
Inhibitor :senyawa atau bahan yang memperlambat reaksi kimia.
Intron :bagian dari DNA gen atau tiruan basa pada gen yang tidak direpresentasikan pada RNA matang (RNA hasil transkripsi yang sudah mengalami proses pasca-transkripsi). Intron akan dibuang dari RNA hasil transkripsi primer (hasil transkripsi primer = RNA hasil transkripsi yang belum mengalami proses pasca transkripsi).
Kodon :tiga basa berurutan pada mRNA yang menyandikan jenis asam amino yang akan dirangkaikan menjadi protein.
Konjugasi :bersatunya sel seks (gamet) atau sel tunggal selama proses fertilisasi. Konjugasi pada E. coli terjadi transfer DNA satu arah yaitu sel donor (sel jantan) ke sel resipien (sel betina).
Ligase :enzim yang menyambungkan ujung dari dua utas DNA.
Ligasi :penyambungan dua atau lebih molekul DNA melalui pembentukan ikatan kovalen.
Lisis :pecahnya sel yang terjadi karena dirusaknya membran sel. Umumnya merupakan kelanjutan dari infeksi oleh virus.
Lokus :posisi tetap pada kromosom yang diisi atau ditempati oleh suatu gen atau salah satu alel dari suatu gen tersebut.
Meiosis :proses dimana jumlah kromosom sel reproduktif berkurang menjadi setengahnya (setengah dari diploid atau setengah dari jumlah kromosom sel somatik). Terjadi melalui proses pembentukan gamet pada hewan atau pada tumbuhan. Merupakan sumber keanekaragaman yang sudah terbentuk melalui rekombinasi.
Melanin :pigmen berwarna coklat gelap.
Metafase :salah satu tahap pembelahan sel dimana kromosom mengatur diri pada satu bidang ekuator. Pada metafase ini, bentuk setiap kromosom tampak jelas perbedaannya satu sama lain.
Mitosis :terpisahnya kromosom yang telah mengalami duplikasi dan pembagian sitoplasma untuk menghasilkan sel anakan (daughter cell) yang identik secara genetik.
Monomer :molekul tunggal yang dapat bergabung dengan molekul yang lebih kompleks. Asam amino merupakan monomer dari protein (asam amino dapat bergabung dengan asam amino lainnya membentuk protein). Nukleotida merupakan monomer dari asam nukleat (nukleotida dapat bergabung dengan nukleotida lainnya membentuk asam nukleat).
mRNA :RNA yang membawa informasi untuk sintesis protein. RNA yang membawa informasi dari DNA menuju ribosom.
Mutan :sel atau individu yang menunjukkan perubahan sebagai akibat mutasi. Sel atau individu yang telah mengalami mutasi.
Mutasi :perubahan DNA pada lokus tertentu dalam suatu organisme. Termasuk mutasi titik, perubahan gen tunggal maupun perubahan kromosom.
Nukleotida :unit penyusun DNA dan RNA. Nukleotida terdiri atas satu gula pentosa, satu basa nitrogen dan satu gugus fosfat.
Operon :sekelompok gen yang membentuk satu unit regulasi. Sekelompok gen yang berada dalam satu unit transkripsi yang berada dalam satu sistem regulasi. Satu operon mengandung satu operator, satu promotor dan gen-gen structural. Transkripsi gen dalam satu operon menggunakan hanya satu promotor.
PCR :Polymerase Chain Reaction suatu reaksi in vitro untuk menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target tersebut dengan bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer dalam suatu thermocycler.
Plasmid :heredity determinant di luar kromosom. Molekul DNA yang berada dalam keadaan otonomi di dalam sel bakteri, bereplikasi sendiri (berupa replikon), ditransfer terpisah dari kromosom. Beberapa plasmid, misalnya plasmid F dapat menyisip pada kromosom.
Polimer :senyawa yang tersusun atas banyak subunit yang lebih kecil, dihasilkan dari proses polimerisasi. Contoh: DNA dan RNA merupakan polimer dari nukleotida (DNA dan RNA = polinukleotida). Nukleotida merupakan monomer dari DNA atau RNA.
Polimerase :enzim yang mengkatalisis pembentukan DNA atau RNA. DNA polimerase mengkatalisis sintesis DNA. RNA polimerase mengkatalisis pembentukan RNA.
Polinukleotida :rangkaian dua atau lebih nukleotida. DNA dan RNA merupakan polinukleotida.
Polipeptida :rangkaian dua atau lebih asam amino dan satu atau lebih gugus peptida. Dinamakan dipeptida bila mengandung dua asam amino, tripeptida bila mengandung tiga asam amino dan seterusnya bergantung pada jumlah asam amino penyusunnya.
Promotor :sekuen nukleotida atau urutan nukleotida pada DNA dimana RNA polimerase akan menempel padanya (menempel pada promotor) dan memulai atau menginisiasi proses transkripsi.
Rekombinan :kombinasi baru. Hasil dari proses rekombinasi.
Rekombinasi :proses produksi rekombinasi gen yang tidak ada pada individu tetua sebelumnya. Proses pembentukan kombinasi baru.
Replikasi :proses penggandaan atau proses duplikasi yang terjadi melalui pengkopian cetakan. Misalnya, reproduksi DNA terjadi melalui proses replikasi.
Replikon :unit replikasi. Unit yang dapat bereplikasi sendiri. Kromosom dan plasmid merupakan replikon.
Ribosom :salah satu organel di dalam sitoplasma dimana pada ribosom ini protein disintesis.
RNA :ribo-nucleic-acid atau asam ribonukleat. Secara umum, RNA merupakan hasil dari transkripsi menggunakan DNA sebagai cetakan. Ada tiga jenis RNA yaitu mRNA yang membawa informasi genetik untuk sintesis protein, rRNA yang merupakan penyusun ribosom (sebagai bahan dari ribosom, ribosom merupakan asosiasi rRNA dan protein), tRNA yang berfungsi untuk membawa asam amino menuju ribosom.
Transduksi :proses masuknya DNA ke dalam sel bakteri melalui perantaraan virus atau fage. Rekombinasi DNA di dalam sel bakteri melalui perantaraan virus atau fage.
Transformasi :proses masuknya DNA dari lingkungan ke dalam sel bakteri. Perubahan bakteri secara genetik yang terjadi atau yang dilakukan dengan memasukkan DNA asing ke dalam sel bakteri.
Transgenik :organisme yang telah berubah secara genetik sebagai akibat telah masuknya DNA asing ke dalam genomnya. Organisme yang mengandung DNA yang berasal dari organisme lain. Contoh: tanaman kapas-bt merupakan tanaman transgenic karena tanaman kapas-bt telah mengandung gen yang berasal dari organisme lain (dalam hal ini mengandung gen yang berasal dari bakteri Bacillus thuringiensis).
Transkriptase balik :enzim yang mengkatalisis sintesis DNA menggunakan RNA cetakan.
Triploid :organisme atau sel yang mempunyai tiga set kromosom (3n). jaringan endosperma jagung merupakan kumpulan sel triploid yaitu mengandung 3 set kromosom.


Readmore »»

Enzim Restriksi

Penemuan molekul DNA yang mempunyai struktur berpilin seperti tali (double helix) oleh Watson dan Crick (1953) telah membuka jalan bagi kelahiran bioteknologi dalam bidang rekayasa genetika. Penemuan struktur DNA tersebut dapat dikatakan sebagai embrio bagi bayi teknologi rekayasa genetika. Setelah 20 tahun dalam kandungan, teknologi tersebut lahir ke dunia pada tahun 1973.
Kelahiran teknologi ini ditandai dengan keberhasilan manusia yang menciptakan teknik dasar yang mutlak diperlukan dalam bioteknologi. Beberapa teknik dasar yang mengantar kelahiran teknologi tersebut di antaranya teknik pemotongan, penggabungan dan pembelahan molekul DNA. Dalam tulisan kali ini, akan dibahas mengenai perangkat yang digunakan dalam memotong DNA menggunakan enzim restriksi.

Pada tahun 1960an, telah ditemukan sekelompok enzim tertentu yang dapat mendegradasi DNA dan menghambat (restrict) proses terjadinya infeksi dari bakteriofage penginfeksi bakteri. Kelompok enzim ini, yang kemudian dikenal sebagai enzim restriksi (Restriction Enzyme), terbukti berperan sangat penting dalam penerapan teknologi DNA rekombinan di abad modern ini untuk memanipulasi DNA. Enzim restriksi adalah enzim yang memotong dsDNA (baca: double stranded DNA) pada situs spesifik. Situs yang dipotong oleh enzim restriksi disebut situs pengenalan enzim (Recognition sequences). Enzim yang berbeda dapat mengenali situs yang berbeda. Enzim yang dihasilkan oleh berbagai jenis bakteri dan secara alami berfungsi untuk melindungi bakteri dari inkorporasi DNA asing.
Penamaan enzim restriksi biasanya berdasarkan inangnya, misalnya EcoRI berasal dari bakteri E. coli. Dalam biologi molekuler, enzim restriksi biasanya digunakan untuk analisis kekerabatan, rekayasa genetika dan identifikasi suatu molekul DNA.
Enzim restriksi mampu memotong DNA pada situs pengenal dengan sekuensi DNA yang sangat spesifik (Recognition site). Dengan demikian enzim ini mampu memproses DNA menjadi potongan-potongan yang lebih pendek asal DNA tersebut memiliki situs pengenal untuk enzim restrisi tertentu. Oleh enzim restriksi ini, DNA genomik tanaman yang relatif kompleks organisasi DNA-nya dapat dipotong-dipotong menjadi populasi potongan DNA dengan berbagai ukuran. Sampai dengan tahun 1988an, telah diketahui hampir 475 macam enzim restriksi yang berasal dari berbagai organisme.
Situs pengenalan enzim restriksi kebanyakan terdiri dari empat basa atau enam basa, tetapi ada juga yang selain itu. Pada umumnya enzim restriksi yang berbeda memiliki situs pengenalan yang berbeda, namun ada beberapa enzim yang diisolasi dari sumber yang berbeda memiliki situs pengenalan yang sama. Enzim-enzim seperti ini disebut isoschizomer, contohnya adalah enzim MboI dan Sau3AI. Walaupun situs pengenalannya sama, aktivitas pemotongannya mungkin beda. Sekuen pengenalan biasanya sama urutan basanya pada kedua utas DNA bila dibaca dengan arah yang sama. Sekuen ini disebut palindromik. Berdasarkan ujung hasil pemotongannya, enzim restriksi dapat memotong dengan ujung lengket/lancip (sticky/cohesive end) dan ujung tumpul (blunt end). Enzim yang memotong pada edua utas tidak berhadapan langsung, tetapi selisih 2-4 basa menghasilkan potongan dengan ujung lengket sedangkan enzim yang memotong pada tempat yang berhadapan menghasilkan ujung tumpul contohnya adalah enzim SmaI.
Hingga saat ini, paling tidak sudah terdapat ribuan enzim yang diperoleh dari berbagai jenis mikroorganisme. Beberapa di antaranya yang terkenal dan sering digunakan adalah enzim EcoRV, HindIII, SacI, TaqI, BamHI, MspI dan lain-lain. Semua enzim tersebut dapat dibeli pada perusahaan-perusahaan bioteknologi dengan harga yang sangat bervariasi seperti Fermentas, Eppendorf, Sigma, Promega, Novagen dan Biogen.


Readmore »»

Sekuensing DNA

Satu dari terobosan utama dalam biologi molekuler adalah perkembangan metode mensekuen potongan DNA secara cepat. Pengurutan asam nukleat memungkinkan kita bisa mengetahui kode genetik dari molekul DNA. Sekuensing dapat dilakukan dengan menggunakan satu dari dua metode yang ada. Kedua metode tersebut menghasilkan fragmen-fragmen DNA dengan panjang bervariasi, yang satu sama lain berbeda sebanyak satu basa tunggal. Dari fragmen-fragmen tersebut, kita bisa menarik kesimpulan mengenai sekuen asam nukleat molekul DNA yang diperiksa. Teknik yang digunakan adalah gel-gel poliakrilamid pendenaturasi (denaturing polyacrilamide gels). Gel agarosa dapat memisahkan molekul-molekul DNA dengan perbedaan panjang 30-50 basa, sedangkan gel poliakrilamid dapat memisahkan molekul-molekul DNA dengan perbedaan panjang satu basa. Gel-gel pendenaturasi menyebabkan molekul DNA menjadi beruntai tunggal dan tetap dalam keadaan seperti itu sepanjang proses elektroforesis. Gel pendenaturasi mengandung urea dan dijalankan dengan suhu yang ditinggikan. Kedua hal tersebut mendorong terjadinya pemisahan kedua untai molekul DNA.

Agar dapat dilihat, DNA harus diberi label. Label yang paling sering digunakan adalah isotop radioaktif, terutama 32P, 33P atau 35P. Setelah elektroforesis, gel dikeringkan dan diletakkan dengan selembar film sinar-X dalam ruang gelap. Selama penyimpanan tersebut, partikel-partikel radioaktif yang dipancarkan dari isotop pada tiap molekul DNA memapar film. Setelah film dicuci, akan tampak pita hitam pada film di posisi pita DNA pada gel. Gambar ini disebut autoradiograf, merupakan bayangan cermin posisi pita DNA pada gel.
Ada dua metode yang dapat digunakan dalam mengurutkan molekul DNA. Metode Maxam-Gilbert merupakan metode yang didasarkan atas pemotongan DNA di daerah spesifik oleh zat-zat kimiawi selain enzim. Akan tetapi, metode ini sekarang jarang digunakan, metode Sanger lebih disukai dan keduanya diperkenalkan pada tahun 1977. Metode Sanger lebih mudah, praktis dan efisien.
Dalam metode Sanger, sintesis DNA secara enzimatik terjadi melalui pembentukan secara berurut ikatan fosfodiester antara gugus fosfat ujung 5’ bebas dari nukleotida baru dengan gugus OH dari ujung 3’ rantai yang sedang memanjang. Proses ini berlangsung sepanjang molekul DNA. Dideoksinuklotida tidak mempunyai gugus OH pada ujung 3’-nya, melainkan gugus H. Adanya dideoksinukleotida menyebabkan sintesis DNA terhenti, karena ikatan difosfat tidak terbentuk. Pemanjangan rantai akan terhenti pada titik ini dan basa terakhir di ujung 3’ rantainya adalah sebuah terminator dideoksi. Modifikasi dari metode Sanger ini disebut dideoxy termination sequencing.
Dalam metode pengurutan Sanger, digunakan empat macam campuran reaksi dalam pengurutan fragmen DNA. Tiap campuran reaksi mengandung molekul DNA cetakan yang akan diurutkan, primer yang telah diberi label dengan radioaktif, keempat deoksinukleotida, DNA polimerase dan empat terminator dideoksi (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP). Jika salah satu dari terminator ini digunakan pada untai DNA yang baru terbentuk, maka sintesis untai baru ini akan terhenti, hasilnya adalah semua untai dengan panjang yang bervariasi pada campuran reaksi akan berakhir dengan basa yang sama. Produk-produk radioaktif tersebut akan dipisahkan dengan elektroforesis dan divisualisasikan melalui autoradiografi. Hasil autoradiografi dibaca dari bawah gel (fragmen terpendek yang berhenti paling dekat dengan ujung 5’) ke arah atas untuk mengetahui sekuen basa komplementer dari untai cetakan.

Proyek-proyek Sekuensing Genom
Sejalan dengan berkembangnya mesin-mesin sekuensing DNA otomatis (Automatic DNA Sequencer), sejumlah organisasi telah memberikan perhatian dan dukungan dana bagi penentuan sekuen genom berbagai spesies organisme penting. Beberapa genom yang ukurannya sangat kecil seperti genom virus HIV dan fag λ telah disekuen seluruhnya. Genom sejumlah bakteri, misalnya E. coli (4,6 x 106 bp) dan khamir Saccharomyces cerevisiase (2,3 x 107 bp) juga telah selesai disekuensing. Sementara itu, proyek sekuensing genom tanaman Arabidopsis thaliana (6,4 x 107 bp) dan nematode Caenorhabditis elegans saat ini masih berlangsung. Proyek genom manusia (Human Genome Project), yang diluncurkan pada tahun 1990 dan sebenarnya diharapkan selesai pada tahun 2005, ternyata berakhir dua tahun lebih cepat daripada jadwal yang telah ditentukan.
Pada genom manusia dan genom-genom lain yang berukuran besar biasanya dilakukan pemetaan kromosom terlebih dahulu untuk mengetahui lokus-lokus gen pada tiap kromosom. Selanjutnya, perpustakaan gen untuk suatu kromosom dikonstruksi menggunakan vektor YACs dan klon YACs yang saling tumpang tindih diisolasi hingga panjang total kromosom tersebut akan tercakup. Demikian seterusnya untuk kromosom-kromosom yang lain hingga akhirnya akan diperoleh sekuen genom total yang sambung-menyambung dari satu kromosom ke kromosom berikutnya.

Pangkalan Data Sekuen DNA
Selama bertahun-tahun telah banyak sekuen DNA yang ditentukan oleh para ilmuwan di seluruh dunia dan saat ini kebanyakan jurnal ilmiah mengisyaratkan penyerahan sekuen DNA terlebih dahulu untuk keperluan data publik sebelum mereka menerima naskah selengkapnya dari para penulis/ilmuwan. Pengelola pangkalan data akan saling bertukar informasi tentang sekuen-sekuen yang terkumpul dan menyediakannya untuk akses publik sehingga semua pangkalan data yang ada akan menjadi nara sumber yang sangat bermanfaat.
Sekuen-sekuen baru terus bertambah dengan kecepatan yang kian meningkat. Begitu pula, sejumlah perangkat lunak komputer diperlukan agar data yang tersedia dapat dimanfaatkan dengan lebih baik.
EMBL di eropa dan GenBank Amerika Serikat merupakan dua pangkatalan data sekuen DNA terbesar di dunia. Selain sekuen DNA, mereka juga mengelola data sekuen RNA dan protein. Sementara itu, beberapa perusahaan mempunyai pangkalan data sekuen DNA sendiri.
Ketika sekuen suatu fragmen DNA telah diketahui, hanya ada sedikit sekali gambaran yang dapat diperoleh dari sekuen tersebut. Analisis sekuen perlu dilakukan untuk mengetahui beberapa karakteristik pentingnya seperti peta restriksi, rangka baca, kodon awal dan kodon akhir atau kemungkinan tempat promotornya. Di samping itu, perlu juga dipelajari hubungan kekerabatan suatu sekuen baru dengan beberapa sekuen lainnya yang telah terlebih dahulu diketahui. Biasanya, analisis semacam itu dilakukan menggunakan paket-paket perangkat lunak, misalnya paket GCG Universitas Wisconsin dan DNAstar.


Readmore »»

Kloning dan Ekspresi Gen pdc

Penelitian tentang kloning gen pdc penyandi pyruvate decarboxylase telah selesai dilaksanakan di laboratorium CBRG LIPI yang dipimpin oleh Budi Saksono, M.Sc. Gen tersebut berperan dalam proses produksi bioetanol secara fermentatif dengan memanfaatkan metabolisme mikroba. Penggunaan GenBank NCBI berperan dalam proses pembuatan desain primer PCR untuk mengamplifikasi gen tersebut.


Penjelasan lebih detail dapat dibaca di link "download"
download pdf

Readmore »»

DNA Genom

Setiap makhluk hidup mempunyai sel yang di dalam inti selnya terdapat kromosom dengan jumlah berbeda-beda untuk setiap makhluk hidup. Manusia misalnya, mempunyai 23 pasang kromosom dalam tiap inti selnya. Sapi mempunyai 30 pasang kromosom, lalat buah Drosophila mempunyai 4 pasang kromosom, bakteri E. coli mempunyai 1 pasang kromosom, dan lain-lain. Total kromosom dalam inti sel dinamakan genom. Lebih tepatnya genom inti karena berasal dari inti sel. Jadi genom manusia terdiri atas 23 pasang kromosom, genom sapi terdiri atas 30 pasang kromosom, dan seterusnya. Apabila DNA dari genom tersebut direntang secara linear, ukuran DNA genom tersebut berbeda-beda pada setiap makhluk hidup. Rentangan DNA dari genom ini disebut Genomic DNA.




Tabel 1. Ukuran genom beberapa makhluk hidup dalam bentuk haploid
Dari tabel di atas, paling tidak ada beberapa poin yang bisa dibuat, yaitu:
1. Besarnya ukuran genom tidak mencerminkan ukuran makhluk hidup. Bandingkan, misalnya, antara ukuran tubuh manusia dan ukuran tubuh tikus. Namun, mereka mempunyai ukuran genom yang hampir sama.
2. Ada kemungkinan bahwa ukuran genom yang hampir sama pada dua makhluk hidup (misalnya manusia dan tikus) mempunyai organisasi genom yang hampir sama pula.
3. Virus dan bakteri merupakan makhluk hidup yang sederhana dimana mereka mempunyai ukuran genom kecil dan berarti pula organisasi genom nya juga sederhana. Oleh karenanya, tidaklah mengherankan apabila kedua makhluk hidup ini menjadi bahan utama untuk penelitian-penelitian dalam bidang genetika molekuler hingga saat ini.

DNA genom terdapat di dalam sel organisme sehingga seluruh bagian tubuh organisme dapat dijadikan sebagai sumber untuk mendapatkan atau mengisolasi DNA. Namun demikian, bagian-bagian tubuh tersebut ada yang mudah dan ada yang agak sulit untuk mempurifikasinya sehingga diperlukan teknik atau perlakuan yang khusus. Hal yang harus diperhatikan adalah prinsip-prinsip pokok dalam purifikasi DNA, yaitu:
1. Penghancuran bagian tubuh/organ menjadi bagian yang kecil
Bahan seperti jaringan otot, organ binatang, bulu rambut dan sebagainya perlu dihancurkan secara fisik dengan menggunakan mortar atau bahan pengeras seperti gas liquid nitrogen. Darah tidak memerlukan penghancuran secara fisik tetapi harus dipisahkan antara bagian yang ada DNA nya dengan yang tidak ada DNA nya dengan cara sentrifugasi kecepatan rendah. Pada mamalia DNA berada pada sel darah putih sedangkan pada reptile dan aves DNA ada di sel darah merah dan darah putih.
2. Penghancuran dinding sel dan lapisan pembungkus DNA
Dinding sel dan bagian pembungkus DNA dapat dilisis secara kimiawi maupun enzimatik atau kombinasi keduanya. Cara yang dipilih tergantung sumber DNA nya. Zat kimia yang digunakan adalah detergen karena dapat menyebabkan protein membran terdenaturasi sehingga struktur membran akan rusak. Bahan kimia yang lain misalnya sucrose, triton-X, NaCl, CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) dan SDS (Sodium Dodecyl Sulphate). Untuk sel bakteri, selain menggunakan detergen, juga dapat digunakan enzim lisozim untuk memecah dinding sel khususnya untuk mengisolasi DNA genom dari bakteri gram positif.
3. Sentifugasi untuk memisahkan DNA dengan debris sel
Setelah dinding sel dan lapisan pembungkus DNA hancur, perlu dipisahkan antara debris sel dengan DNA. Pemisahan dilakukan dengan sentrifugasi kecepatan rendah (6500 rpm) untuk DNA mitokondria atau sentrifugasi kecepatan tinggi (13000 rpm) untuk DNA total.
4. Ekstraksi untuk memisahkan DNA dari materi organik lain
Pemurnian DNA biasanya dengan menggunakan fenol-kloroform-isoamil alkohol atau ammonium asetat yang akan mengendapkan protein.
5. Koagulasi dan pengendapan (Presipitasi DNA)
Presipitasi DNA bisa dengan menggunakan etanol absolut atau isopropanol. Keduanya bersifat polar sehingga dapat menarik molekul air dari DNA, sehingga DNA mengendap.
6. Pencucian, pengeringan dan pelarutan kembali
Setelah DNA murni dapat diendapkan, harus dicuci dengan etanol 70% kemudian diendapkan dengan cara sentrifugasi. Setelah pencucian endapan DNA dikeringkan untuk membebaskannya dari sisa-sisa etanol.

Kemajuan dan penemuan baru di bidang bioteknologi memang luar biasa. Ditemukan DNA polymerase yang tahan panas dengan kemampuan membaca yang akurat, juga alat sekuens DNA pipa kapiler menyebabkan penelitian pembacaan genom menghasilkan prestasi luar biasa. Dengan perkembangan teknologi rekayasa genetika yang sangat pesat, saat ini terdapat puluhan bahkan ratusan laboratorium di seluruh dunia berlomba-lomba mempelajari genom makhluk hidup. HUGO (Human Genome Organization) yang dipimpin sendiri oleh Watson (penemu struktur DNA double helix), misalnya, terus mempelajari genom manusia dengan markasnya di USA. Ada lagi MARGO (Marsupial Genom Organization) yang bermarkas di Australia yang mempelajari genom kanguru dan masih banyak lagi yang lainnya.
Dengan mempelajari bagaimana genom memprediksikan fungsi suatu gen, maka manusia dapat memprediksikan pula biologi suatu organisme. Lompatan besar dalam peningkatan mutu vaksin, perbaikan alat untuk mendiagnosis penyakit, penemuan obat-obatan baru, penemuan biokatalis untuk industri.


Readmore »»

Virus dan Peranannya dalam kehidupan Manusia

Negara Indonesia beberapa tahun ini disibukkan dengan penanganan penyakit menular yang diakibatkan oleh mikroorganisme virus, penyakit flu burung yang menyebabkan kematian dengan penularan yang sangat cepat dengan perantara hewan unggas. Penyakit ini merupakan penyakit berbahaya bukan karena mampu menyebabkan kematian banyak unggas dalam waktu yang relatif singkat, melainkan karena sifatnya yang dapat menular dari unggas ke manusia dan menimbulkan kematian yang cepat pada manusia. Meskipun namanya flu burung namun ternyata penyakit ini juga menyerang hewan lain seperti babi, kucing dan musang.

Istilah virus memiliki arti racun. Keberadaan virus mempunyai dua fase, yaitu di dalam sel hidup dan di luar sel hidup. Di luar inangnya virus mempunyai ciri tersendiri, yaitu mempunyai partikel sangat kecil yang hanya dapat dilihat dengan mikroskop elektron dan mereka bisa lolos melewati pori-pori saringan yang tidak memungkinkan dilewati oleh bakteri. Mereka memperbanyak diri hanya di dalam sel-sel hewan, tumbuh-tumbuhan dan mikroorganisme lain. Dengan demikian, dapat dikatakan virus sebagai parasit obligat. Apakah hal tersebut sudah dibuktikan?
Bukti yang pertama kali dilakukan oleh D.J. Ivanovsky (seorang ahli botani dari Rusia) pada tahun 1892, yaitu dengan membuat preparat dari ekstrak daun tembakau yang terserang penyakit mozaik tembakau. Selanjutnya ekstrak tersebut disaring melalui penyaringan yang demikian halusnya sehingga setiap bakteri yang ada dapat tersaring. Cairan hasil penyaringan kemudian dioleskan pada daun yang sehat. Hasilnya ternyata di luar dugaan, yaitu daun menjadi sakit. Kasus tersebut dilanjutkan oleh Wendell Stanley pada tahun 1935 dari Amerika Serikat, yang berhasil mengisolasi dan mengkristalkan virus mozaik tembakau. Apabila Kristal virus diinjeksikan pada tanaman yang sehat, maka virus akan segera aktif mengganda, yang berarti hal tersebut bukan sel, jadi virus berbeda dengan bakteri.
Ukuran Virus
Virus adalah partikel berukuran sangat kecil yang dapat menginfeksi hampir semua jenis makhluk hidup. Kita tidak dapat melihat virus dengan mata telanjang, tetapi harus menggunakan mikroskop elektron, karena ukurannya sangat mikroskopik. Virus mempunyai ukuran sekitar 20-30 nanometer (nm), 1 nm = 1/1.000.000.000 meter. Ukurannya rata-rata 50 kali lebih kecil daripada bakteri.
Bentuk Virus
Virus mempunyai struktur yang sederhana, yang hanya terdiri atas selubung atau protein pelindung yang disebut kapsid yang tersusun atas molekul protein dan bagian isi yang tersusun atas asam nukleat berupa DNA atau RNA, dapat pula dilengkapi dengan pembungkus atau envelope dari lipoprotein (lipid dan protein) yang membungkus membran plasma dan berasal dari sel inang virus. Apabila pembungkus ini dibangun oleh subunit yang sama atau identik disebut kapsomer. Bentuk kapsomer ini sangat simetris dan suatu saat dapat mengkristal. Gabungan kapsomer ini akan membentuk kapsid. Dengan demikian dapat diketahui, sebuah virus memiliki bagian-bagian, yaitu memiliki materi genetik yang terbungkus oleh pembungkus protein yang dinamakan virion atau partikel virus. Jadi, virus tidak memiliki sitoplasma serta tidak memiliki organela sehingga tidak melakukan metabolisme. Lebih sederhana manakah antara sebuah sel dengan sebuah virus?


Gambar 1. Salah satu Ilustrasi Bentuk Virus
Peranan virus dalam kehidupan manusia
Coba amatilah keadaan lingkungan! Seperti yang kita lihat, virus kebanyakan bersifat merugikan karena jenis-jenis virus yang berbeda yang menginfeksi dan menyebabkan berbagai penyakit pada tumbuhan, hewan dan manusia. Tetapi dengan kelebihannya, manusia dapat menemukan virus yang dapat dimanfaatkan. Berikut ini akan diuraikan contoh-contoh virus yang menguntungkan dan merugikan.
Virus yang menguntungkan
1. Pembuatan Antitoksin
Para ahli memanfaatkan dengan menggabungkan sifat-sifat DNA yang menguntungkan antara virus dan gen lain sehingga sifat yang menguntungkan tersebut akan dimiliki oleh bakteri yang diinfeksi. Contohnya, DNA virus digabungkan dengan DNA manusia yang memiliki sifat antitoksin (pelawan racun/penyakit). Selanjutnya, virus tersebut diinfeksikan dengan sel bakteri sehingga sel bakteri ini memiliki sifat gen manusia, yaitu memiliki sifat antitoksin. Dengan demikian, bakteri yang semula tidak mempunyai sifat antitoksin sekarang sudah memiliki sifat antitoksin.
Apabila bakteri tersebut membelah terus-menerus, berarti setiap sel bakteri memiliki sifat antitoksin dan selanjutnya dapat diberikan pada manusia. Contohnya, toksoid tetanus, toksin ini disuntikkan pada manusia untuk mencegah penyakit tetanus. Toksin ini biasanya diberikan kepada ibu hamil dan calon pengantin. Adapun bagi penderita tetanus akan diberikan ATS (Anti Tetanus Serum).
2. Untuk melemahkan bakteri
Apabila virus yang menginfeksi bakteri bersifat pathogen, maka DNA virus yang masuk akan merusak DNA bakteri sehingga bakteri tersebut menjadi tidak berbahaya karena sifat patogennya telah rusak. Contohnya, bakteri difteri yang berbahaya akan berubah sifatnya jika di dalamnya tersambung oleh virus profage.
3. Untuk memproduksi vaksin
Anda tentu pernah mendapat vaksin untuk mencegah terserangnya tubuh dari beberapa jenis penyakit. Vaksin digunakan manusia untuk memperoleh kekebalan tubuh/antibodi. Vaksin ini sebenarnya merupakan bibit penyakit yang telah dilemahkan dan apabila menyerang manusia tidak akan berbahaya lagi. Untuk itulah diperlukan vaksin bagi tubuh kita. Jika ada penyakit yang menyerang manusia, maka tubuh telah memiliki kekebalan yang berasal dari antibodi bagi penyakit tersebut. Contohnya, vaksin cacar, polio dan campak.
Metode pengobatan yang paling dianggap efektif adalah vaksinasi untuk merangsang kekebalan alami tubuh terhadap proses infeksi, sedangkan penggunaan antibiotik diantisipasikan untuk mengatasi gejala infeksi virus, yang sama sekali tidak mempunyai pengaruh terhadap kehidupan virus. Efek samping penggunaan antibiotik adalah resistensi bakteri terhadap antibiotik. Untuk itu diperlukan pemeriksaan lebih lanjut apakah suatu penyakit disebabkan oleh bakteri atau virus.
Virus yang merugikan
Sebagian besar virus bersifat merugikan, yaitu dapat menimbulkan berbagai penyakit pada hewan, tumbuhan maupun manusia.
Salah satu virus yang dianggap paling bahaya adalah filovirus. Grup ini terdiri atas Masburg ditemukan di Jerman tahun 1967 dan ebola. Filovirus adalah virus berbentuk panjang seperti cacing, dalam jumlah yang besar tampak seperti sepiring mie. Pada April 2005 virus Masburg penyebarannya sampai Angola. Sejak oktober 2004 hingga 2005, kejadian ini menjadi epidemis terburuk di dalam kehidupan manusia.
Virus penyebab penyakit pada manusia
Beberapa jenis penyakit pada manusia yang disebabkan oleh virus adalah sebagai berikut:
1. Influenza
Tentu anda pernah menderita sakit flu. Apa yang anda rasakan ketika terserang penyakit flu? Ada beberapa gejala penyakit flu, antara lain sakit kepala, batuk, demam


Readmore »»

Sejarah Perkembangan Fermentasi

Suatu bahan yang ditumbuhi oleh mikroba akan mengalami perubahan struktur kimianya. Fermentasi merupakan proses yang menghasilkan alkohol atau asam organik, misalnya terjadi pada bahan yang mengandung karbohidrat. Dalam dunia mikrobiologi industri, pokok bahasan utama adalah fermentasi.

Tahap pertama industri fermentasi dimulai sebelum tahun 1900, yaitu mulai pembuatan alkohol dan vinegar. Tahun 1837, C. Latour, Th. Schwanndon dan F. Kutzing secara terpisah menemukan bahwa zat gula mengalami fermentasi alkohol selalu dijumpai adanya khamir. Sehingga dapat disimpulkan bahwa perubahan gula menjadi alkohol dan CO2 merupakan fungsi fisiologis dari sel khamir tersebut. Teori biologis ini ditentang oleh Jj. Berzelius, J. Liebig dan F. Wahler. Mereka berpendapat bahwa fermentasi dan pembusukan merupakan reaksi kimia biasa. Hal ini dapat dibuktikan pada tahun 1812 telah berhasil disintesis senyawa organik urea dari senyawa anorganik. Pasteur banyak meneliti tentang proses fermentasi (1875-1876). Suatu saat perusahaan pembuat anggur dari gula bit, menghasilkan anggur yang masam. Berdasarkan pengamatannya secara mikroskopis, sebagian dari sel khamir diganti kedudukannya oleh sel lain yang berbentuk bulat dan batang dengan ukuran sel lebih kecil. Adanya sel-sel yang lebih kecil ini ternyata mengakibatkan sebagian besar proses fermentasi alkohol tersebut didesak oleh proses fermentasi lain, yaitu fermentasi asam laktat. Dari kenyataan ini, selanjutnya dibuktikan bahwa setiap proses fermentasi tertentu disebabkan oleh aktivitas mikroba tertentu pula, yang spesifik untuk proses fermentasi tersebut. Sebagai contoh fermentasi alkohol oleh khamir, fermentasi asam laktat oleh bakteri Lactobacillus dan fermentasi asam sitrat oleh jamur Aspergillus. Di arab, produksi dalam skala besar dimulai tahun 1700. Pengembangan proses dengan menggunakan thermometer dimulai tahun 1757 dan pemindahan panas pada tahun 1801. Pada pertengahan abad 19, fungsi khamir dalam fermentasi alkohol mulai dikembangkan. Pada akhir abad 19 mulai digunakan kultur murni pada pembuatan starter.
Vinegar pada mulanya dihasilkan dari oksidasi wine karena perkembangan mikroba liar. Perkembangan kemudian dengan menggunakan generator yang diikuti dengan medium penyangga. Pada akhir abad 19 dan awal abad 20 mulai digunakan medium yang dipasteurisasi dan ditambah 10% vinegar yang baik untuk menjadikan asam dan mencegah kontaminasi. Jadi konsep proses mulai dikembangkan pada awal abad 20.
Tahap kedua yaitu pada tahun 1900-1940 dengan mulai dikembangkan produk baru seperti massa sel khamir, gliserol, asam sitrat, asam laktat dan aseton-butanol. Pembuatan ragi roti merupakan proses aerob sehingga sel tumbuh cepat. Jika oksigen tidak ada maka yang dihasilkan alkohol dan bukan sel khamir. Masalah pembatas adalah konsentrasi wort awal, karena pertumbuhan sel dibatasi oleh kemampuan penggunaan sumber karbon daripada oksigen. Pertumbuhan sel juga dipengaruhi oleh penambahan wort dalam jumlah kecil selama proses. Teknik ini sekarang disebut sebagai kultur fed batch dan secara luas digunakan dalam fermentasi industri dengan oksigen sebagai pembatas. Perkembangan fermentasi aseton butanol secara aseptis selama perang dunia II dipelopori oleh Weizmann.
Pada tahap ketiga mulai dihasilkan penisilin pada kultur submerged secara aseptis. Produksi penisilin secara aerob sangat mudah mengalami kontaminasi, terutama pemasukan udara dalam skala besar. Program pengembangan strain dilakukan dalam pilot plant. Pada tahap ini (1940 sampai sekarang) banyak ditemukan proses-proses baru diantaranya antibiotik yang lain, vitamin, giberelin, asam amino, enzim dan transformasi steroid.
Tahap keempat (1960 sampai sekarang), sejumlah perusahaan besar meneliti tentang produksi protein sel tunggal untuk ternak. Tahap ini merupakan pengembangan tahap ke tida dengan skala lebih besar, dengan kemungkinan harga jual yang lebih rendah. Mulai tahap ini semakin diperhatikan kontrol peralatan dan proses menggunakan kontrol komputer dan mulai dilakukan penelitian strain yang digunakan melalui rekayasa genetik.
Tahap kelima (1979 sampai sekarang) mulai diteliti dan diproduksi senyawaan yang tidak umum dihasilkan mikroba seperti interferon, insulin dengan manipulasi genetik. Produksi konvensional juga dapat ditingkatkan melalui rekayasa genetik. Perkembangan tahap ini semakin canggih sesuai perkembangan bioteknologi.

Readmore »»

Plasmid

Kendaraan merupakan salah satu alat untuk memindahkan sesuatu dari satu tempat ke tempat lain. Dalam bioteknologi rekayasa genetika yang telah melanda dunia saat ini, kendaraan juga diperlukan dan merupakan kebutuhan mutlak. Kendaraan yang digunakan dalam bioteknologi ini berfungsi sebagai alat untuk memindahkan gen (sepotong molekul DNA) dari satu organisme ke organisme hidup lain. Dalam bioteknologi, kendaraan tersebut dikenal dengan nama vector. Adapun gen yang bisa dipindahkan dapat berasal dari molekul DNA manusia, hewan, tumbuhan dan semua organisme hidup lainnya. Oleh karena jenis kendaraan ini berasal dari sel organisme hidup, kita sebut saja kendaraan ini sebagai biotransport.

Pada umumnya bakteri mempunyai satu kromosom berupa DNA sirkular. Namun, disamping memiliki kromosom tersebut, bakteri juga memiliki DNA sirkular lainnya yang ukurannya jauh lebih kecil daripada DNA kromosomnya. Materi ini disebut dengan plasmid yang merupakan DNA bakteri yang terpisah dari DNA kromosomnya. Plasmid merupakan satu dari beberapa jenis biotransport yang paling populer digunakan dalam bioteknologi rekayasa genetika. Beberapa karakteristik dari plasmid adalah molekul DNA utas ganda sirkuler (tidak berujung), berukuran kecil, terdapat dalam sitoplasma namun di luar kromosom (ekstra kromosom) dan dapat melakukan replikasi secara autonom, secara genetik dapat ditransfer dengan stabil, mengandung berbagai jenis gen. Jenis, jumlah jenis dan jumlah tiap jenis (copy) plasmid bervariasi antar sel. Bahkan antar sel dalam satu spesies bakteri. Plasmid terdapat di dalam sitoplasma organisme prokariot dan eukariot sederhana uniseluler. Selain dalam bakteri, plasmid juga terdapat dalam Saccharomyces cerevisiae. Pada kelompok prokariot, plasmid diketahui memiliki ukuran yang sangat bervariasi antara kurang dari 1 juta Dalton sampai 200 juta Dalton. Sifat fenotipe dari plasmid biasanya telah teridentifikasi, misalnya tahan terhadap antibiotik, memproduksi antibiotik, degradasi aroma, tahan terhadap logam berat, fermentasi gula dan lain-lain. Namun, ada pula plasmid yang belum teridentifikasi sifat fenotipe-nya dan disebut sebagai plasmid cryptic.
Dalam teknik rekayasa genetika, plasmid biasanya digunakan sebagai vektor untuk kloning. Plasmid juga dapat dipindahkan antar sel bakteri dengan cara konjugasi atau transformasi. Plasmid mulai digunakan sebagai vektor untuk mengklon gen tidak lama setelah David Jackson, Robert Simon dan Paul Berg berhasil membuat molekul DNA rekombinan itu pada tahun 1972. Dalam hal ini, plasmid digunakan sebagai pembawa fragmen DNA asing. Dengan kata lain, plasmid dikombinasikan dengan DNA asing. Plasmid rekombinan yang pertama kali berhasil bereplikasi di dalam sel bakteri adalah plasmid pSC101 yang telah dikonstruksi oleh Stanley Cohen dan Herbert Boyer (SC=Stanley Cohen).
Penamaan plasmid biasanya diawali dengan “p” diikuti oleh serangkaian kode yang menunjukkan identitas plasmid tersebut. Contoh plasmid yang umum digunakan sebagai vektor adalah pUC118, pUC119, pBR322. Plasmid-plasmid ini masing-masing membawa gen penanda resistensi terhadap antibiotik yang dapat digunakan sebagai dasar dalam seleksi koloni yang membawa plasmid dan yang tidak. Beberapa plasmid memiliki MCS (Multiple Cloning Site) pada gen lacZ yang menyandikan enzim β-galactosidase, sehingga memungkinkan melakukan seleksi biru putih. Jika vektor tersebut telah membawa gen tertentu, di belakang nama plasmid juga disertakan keterangan mengenai gen yang dibawanya (contoh: pAP01 (amyH), berarti plasmid hasil konstruksi ini mengandung gen amyH).
Untuk mengisolasi DNA plasmid dari keseluruhan genom yang dimiliki oleh bakteri, biasanya digunakan metode lisis alkali atau sentrifugasi dalam gradien CsCl. Kedua metode ini akan memisahkan DNA plasmid dari DNA kromosom berdasarkan kerapatannya. Pada metode lisis alkali, sel bakteri dilisis dalam suasana alkali sehingga dsDNA akan terdenaturasi menjadi ssDNA. Setelah dinetralkan, DNA plasmid yang berukuran lebih kecil dibandingkan DNA kromosom akan lebih cepat mengalami renaturasi. Selanjutnya dengan sentrifugasi keduanya dapat dipisahkan. Metode ini dapat menghasilkan plasmid dengan kemurnian yang tinggi.
Berdasarkan metode lisis alkali, sekarang ini telah banyak dikembangkan suatu kit untuk isolasi plasmid. Dibandingkan dengan metode lisis alkali konvensional, dengan menggunakan kit, pekerjaan menjadi lebih cepat dan mudah. Untuk mendapatkan kemurnian yang tinggi, biasanya kit semacam ini menggunakan agen pengikat DNA dalam bentuk beads atau spin column yang akan mengikat DNA dengan kuat sehingga pengotor lainnya dapat dihilangkan saat pencucian. Setelah itu, DNA dapat diperoleh kembali dengan menambahkan suatu larutan yang dapat melepaskan ikatan antara DNA dengan agen tersebut (proses elusi).


Gambar 1. Beberapa contoh site map Plasmid
Salah satu contoh plasmid yang telah lama digunakan sebagai vektor untuk mengklon gen adalah plasmid pBR322. Plasmid tersebut mengandung gen penyandi resistensi terhadap ampisilin dan tetrasiklin. Pada gambar di bawah ditunjukkan adanya berbagai situs yang telah dipotong oleh enzim restriksi. Adanya gen resistensi terhadap antibiotik di dalamnya mengandung situs enzim restriksi yang akan memberikan kemudahan dalam menyeleksi plasmid rekombinan atau memudahkan dalam menyeleksi klon bakteri yang telah membawa plasmid rekombinan. Akan lebih memudahkan lagi dengan adanya enzim yang memotong pada bagian gen resistensi terhadap antibiotik. Misalnya enzim PstI yang hanya akan memotong pBR322 pada bagian gen resistensi terhadap ampisilin (gen ApR).
Contoh plasmid lainnya yang telah lama digunakan sebagai vektor untuk mengklon gen adalah plasmid pUC118 dan pUC119. Plasmid ini merupakan pengembangan dari pBR322. Plasmid pUC118 dan pUC119 mengandung gen lacZ yang menyandikan enzim β-galaktosidase. Pada lacZ terdapat daerah yang disebut daerah polikloning. Pada daerah ini terdapat banyak situs restriksi dari berbagai enzim restriksi. Dalam hal ini, kita dapat menggunakan berbagai enzim restriksi untuk memotong pUC118 dan pUC119 pada bagian lacZ. Bila gen lacZ disisipi oleh DNA asing maka gen lacZ tersebut tidak berfungsi (tidak menghasilkan β-galaktosidase). Bila kita menggunakan pUC118 atau pUC119 sebagai vektor, maka koloni yang membawa plasmid rekombinan dapat dideteksi dengan menggunakan Xgal (5-bromo-4-chloro-indolyl-β-D-galactosida). Enzim β-galaktosidase akan memecah Xgal menjadi galaktosa dan 5-bromo-4-chloroindigo yang berwarna biru. Koloni bakteri akan berwarna putih bila pUC118 atau pUC119 telah disisipi DNA asing pada bagian lacZ. Dalam hal ini sel bakteri tidak menghasilkan enzim β-galaktosidase karena gen lacZ. Gen lacZ tidak berfungsi karena disisipi oleh DNA asing.
Dari beberapa perangkat di atas (enzim restriksi, enzim DNA ligase dan plasmid) telah memungkinkan bagi kita untuk mengklonkan gen atau fragmen DNA. Dalam hal ini, kita dapat membuat plasmid rekombinan (plasmid yang mengandung fragmen DNA asing) di dalam tabung reaksi. Bila dikombinasikan dengan salah satu cara bakteri memindahkan DNA yaitu transformasi, kita dapat memasukkan plasmid rekombinan tersebut ke dalam sel bakteri.



Readmore »»