Faktor yang menentukan keberhasilan PCR

Keberhasilan PCR ditentukan oleh beberapa hal yang akan dijelaskan lebih detail dalam tulisan kali ini. Keunggulan metode PCR adalah kemampuannya dalam melipatgandakan suatu fragmen DNA sehingga dapat mencapai 109 kali lipat. Dengan demikian, kontaminasi fragmen DNA dalam jumlah sangat sedikit sekalipun dapat menyebabkan terjadinya kesalahan yaitu dengan didapatkannya produk amplifikasi yang tidak diinginkan atau bahkan tidak spesifik.

1. Konsentrasi dan kualitas DNA
Konsentrasi DNA sebesar 0,01-0,1 µg setiap µl larutan template sudah cukup baik untuk PCR namun yang paling penting adalah DNA harus bebas dari pengotor seperti protein atau bahan-bahan yang tersisa saat purifikasi seperti fenol atau alkohol. Purifikasi dapat dilakukan dengan menggunakan GFX DNA Column. DNA yang digunakan sebagai cetakan dapat berupa rantai tunggal maupun rantai ganda. Efisiensi amplifikasi biasanya dapat lebih tinggi jika menggunakan molekul DNA yang sudah dilinearkan dengan suatu enzim restriksi tertentu daripada menggunakan DNA yang berbentuk sirkular (Sambrook et al., 1989).
2. Temperatur Annealing dari kedua primer
Ukuran dan komposisi primer sangat mempengaruhi temperatur penempelan primer terhadap untaian DNA target. Umumnya primer sebesar 17-30 basa nukleotida dengan komposisi GC lebih dari 50%.
3. Konsentrasi MgCl2
Konsentrasi MgCl2 sangat mempengaruhi spesifikasi produk PCR, aktivitas serta kekhususan kerja enzim, penguatan primer mencapai suhu optimumnya (primer annealing) dan penguatan fungsi primer dalam sintesis pemanjangan rantai nukleotida. Konsentrasi optimumnya 1,5-4,0 mM. Namun, apabila preparasi DNA banyak menggunakan EDTA untuk pengawetnya maka MgCl2 akan lebih tinggi dari keadaan normal.
4. Enzim Polimerase
Konsentrasi enzim yang digunakan sangat tergantung dari jenis enzim. Pada umumnya konsentrasi optimum berkisar antara 1,0-2,5 unit enzim setiap volume reaksi 50 µl. Sebaiknya pemakaian enzim tidak melebihi 2,5 unit karena malah justru akan menurunkan spesifitasnya.
5. Konsentrasi dan kualitas primer
Kualitas primer sangat tergantung pada kualitas oligoprimer dan OD (optical density). Namun demikian, konsentrasi primer sekitar 20 pmol sudah cukup memadai untuk amplifikasi PCR. Konsentrasi primer yang lebih tinggi dari 1,0 µM dapat menyebabkan terakumulasinya hasil polimerisasi yang nonspesifik. Primer-primer yang akan digunakan (baik forward primer maupun reverse primer sebaiknya mempunyai nilai Tm (melting temperature) yang serupa. Tm adalah suhu pada saat setengah dari molekul DNA mengalami denaturasi. Nilai Tm oligonukleotida dapat dihitung dengan menggunakan formula Tm = 2 (A+T) + 4 (G+C).
6. Jumlah Siklus PCR
Jumlah siklus terkait dengan konsentrasi awal DNA target dan konsentrasi akhir yang diharapkan. Siklus yang terlalu banyak justru akan meningkatkan konsentrasi produk yang tidak spesifik, sedangkan siklus yang terlalu sedikit akan mengurangi kuantitas produk yang diharapkan.
7. Deoksinukleotida triphosphate (dNTP)
Konsentrasi dNTP mix yang menghasilkan keseimbangan optimal terdiri atas dATP, dCTP, dGTP, dTTP sebesar 10-20 µM. Umumnya produk ini sudah didapatkan dalam bentuk mix dan ready stock. Namun, jika masih dijumpai dalam bentuk terpisah, sebaiknya keempat komponen tersebut memiliki konsentrasi yang sama ketika akan digunakan untuk memperkecil kemungkinan kesalahan penggabungan nukleotida selama proses polimerisasi. Menurut Gelfand dan White (1990), konsentrasi dNTP sebesar 20 µM dalam 100 µl secara teoritis cukup untuk mensintesis 2,6 µg atau 10 pmol DNA yang mempunyai panjang 400 bp.
8. Materi Pendukung berupa larutan penyangga (buffer PCR) yang direkomendasikan mengandung
a) Tris-HCl 10-50 mM dengan pH 8,3-8,8 dan suhu 20°C
b) KCl 10-20 mM yang dapat membantu proses annealing (catatan: menggunakan konsentrasi lebih dari 50 mM dapat menghambat aktivitas Taq DNA Polymerase)
c) (NH4)2SO4 10 mM
d) Gelatin atau albumin serum sebesar 100 µg/ml
e) Ion detergen seperti Tween 20 atau Laureth 12 sebesar 0,05-0,1% untuk mempertahankan kestabilan enzim Taq DNA Polymerase.
Selain faktor di atas yang berhubungan dengan komponen PCR, ada beberapa kiat yang bisa diterapkan saat akan mengerjakan proses PCR sehingga dapat menunjang keberhasilannya. Antara lain:
1. Kecermatan dalam Teknik Laboratorium
a) Usahakan selalu memakai sarung tangan dan gantilah sarung tangan tersebut kalau sudah terkotori oleh komponen atau reagen yang digunakan dalam PCR maupun kotoran lain. Hal ini dimaksudkan untuk memperkecil kemungkinan kontaminasi silang antar sampel PCR.
b) Usahakan untuk membuka maupun menutup tabung dengan hati-hati sehingga tidak ada cipratan komponen reaksi, baik pada tangan maupun pada peralatan yang lain. Ada baiknya untuk selalu melakukan sentrifugasi secara cepat (spin down) setiap kali melakukan campuran, sehingga seluruh komponen yang tercampur berada di bagian bawah tabung.
2. Pemisahan Pekerjaan PCR dari Reaksi yang lain
Sebaiknya tempat untuk melakukan PCR dipisahkan dari tempat untuk melakukan manipulasi genetik yang lain seperti ligasi dan analisis restriksi karena hal tersebut merupakan sumber kontaminasi yang paling potensial (melibatkan fragmen-fragmen DNA). Jika fragmen tersebut mengkontaminasi tabung PCR, hal ini dapat memberikan hasil positif yang palsu (false positives). Ketaatan dalam mengikuti prosedur dapat mengurangi resiko kontaminasi. Cara yang cepat dan sederhana dalam menyiapkan sampel dapat pula mengurangi false prositives (Kwok dan Hiraguchi, 1989).
3. Mikropipet dan Tip
Kedua hal tersebut merupakan sumber kontaminasi yang rawan. Oleh karena itu sebaiknya digunakan positive displacement pippetes yaitu suatu pipet yang menggunakan tip khusus dan mempunyai plunger di dalamnya yang digunakan sebagai penekan cairan yang akan dimasukkan ke tabung dan sekaligus memisahkan cairan reagen dari pipet mikro penyedotnya sehingga tidak ada kemungkinan cairan reagen tersebut masuk ke dalam pipet mikro penyedotnya.
Hal yang terpenting adalah “jangan sekali-kali menggunakan lagi tip yang sudah pernah digunakan sebelumnya, baik untuk PCR maupun untuk manipulasi genetik yang lain, meskipun tip tersebut sudah dicuci.
4. Sumber Kontaminasi yang lain
a) DNA plasmid atau phage yang mengandung sekuen target yang akan diamplifikasi.
b) Fragmen DNA restriksi yang telah dipurifikasi dan akan digunakan sebagai sekuen target.
c) Mesin sentrifugasi
d) Campuran es kering-etanol yang digunakan untuk mengendapkan DNA
5. Penggunaan Kontrol
Untuk mengetahui ada tidaknya kontaminan di dalam komponen PCR, ada baiknya kita menggunakan kontrol dengan mencampurkan komponen PCR namun tanpa diberi DNA cetakan. Selain itu, juga dapat digunakan control yang lain yaitu suatu DNA plasmid yang secara teoritis bukan merupakan DNA cetakan.
Teknik PCR dapat digunakan untuk diagnosis, identifikasi, analisis kekerabatan, kloning, dll. Teknik ini dapat dikombinasikan dengan teknik lain untuk analisis kekerabatan misalnya dengan RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) dan Sekuensing.

DAFTAR PUSTAKA
Gelfand, D. H and White, T. J. 1990. Thermostable DNA Polymerase for PCR Protocols: A Guide to Methods and Aplications. San Diego: Academic Press Inc.
Sambrook, J; Fritsch and Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second Edition. Cold Spring Harbour: Laboratory Press.
Yuwono, T. 2006. Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction. Jogjakarta: Penerbit ANDI. Hal: 17-23.