Kekhawatiran dan ketidaknyamanan tidak adanya tempat restriksi (restriction site) menjadi bukan masalah lagi bila menggunakan sistem kloning menggunakan rekombinase (recombinase-mediated cloning system). Kloning fragmen DNA menggunakan enzim restriksi dapat diibaratkan seperti naik pesawat terbang yang harus transit beberapa kali untuk sampai ke tempat tujuan. Kita bisa sampai ke tempat tujuan, tetapi memerlukan waktu lebih lama dari waktu yang seharusnya. Selain waktu yang lebih lama, tempat restriksi tidak selalu ada pada daerah yang diinginkan dan kadang-kadang juga tidak ditemukan di dalam vektor.
Sistem kloning dengan bantuan rekombinase, memungkinkan peneliti dapat memindahkan DNA dari satu plasmid ke plasmid lain tanpa memerlukan enzim restriksi, sehingga menyederhanakan proses kloning. Selain itu juga bisa menjadi solusi atas masalah yang datang pada saat fragmen DNA (insert) yang akan kita sisipkan tidak memiliki tempat atau tempatnya tidak tepat.
Sistem seperti ini sangat berguna untuk memindahkan insert, dari suatu vektor ke vektor lain. Sebagai contoh sistem ini mempunyai tujuan untuk menandai protein di kedua ujung amino (N) dan karboksilnya (C), sehingga protein tersebut menjadi menyala atau tidak menyala, atau membuat konstruksi ekspresi pada sistem yang bervariasi. Beberapa metode telah dijelaskan secara detail, sampai saat ini sudah ada tiga jenis yang sudah dikomersialkan, yaitu Cre/Iox, Flp/Frt dan rekombinase lambda.
Sistem Gateway
Teknologi Gateway yang dikembangkan oleh invitrogen, Carlsbad-California menggunakan rekombinase lambda yang disebut sebagai Clonase yang mengkatalisa terjadinya rekombinasi secara in vitro antar sekuen yang diapit oleh fragmen 25 bp ATT. Seringkali, sekuen tersebut berada pada plasmid yang berbeda, bila memindahkan sebuah insert dari vektor donor (entry) ke vektor resipien (destination). Tetapi, invitrogen juga memiliki sistem untuk mengkloning fragmen DNA secara langsung ke dalam plasmid menggunakan Clonase, suatu sistem yang tidak memiliki enzim restriksi dan ligase. Dengan menggunakan kit konstruksi pustaka cDNA CloneMiner (harganya 1.221 dollar US dan dapat digunakan untuk 5 kali konstruksi). Pengguna dapat membuat pustaka cDNA utuh secara langsung ke dalam plasmid donor yang sesuai.
Perusahaan telah mendesain bermacam-macam vektor resipien yang bisa digunakan untuk mengganggu transkripsi RNA (dikenal dengan RNA interference), menandai target dengan gen yang menyala (fluorescent tag) dan ragi. Dengan demikian, sistem ini adalah sangat serbaguna seperti yang diungkapkan oleh Pieter de Jong (ketua peneliti di BACPAC, pusat penelitian dan rumah sakit anak, Oakland-California).
Sistem Gateway telah memberikan kemudahan kepada peneliti. Proyek ORFemoe pada Caenorhabditis elegans mendistribusikan 10.000 klon atau lebih ke dalam sistem Gateway dan tim kloning cDNA di pusat studi genom eukariotik (CESG) di universitas Winsconsin-Madison, telah menggunakan Gateway untuk membuat konstruksi ekspresi sekitar 4000-5000 buah.
Tetapi menurut salah seorang staf peneliti CESG, Russel Wrobel, tim merencanakan untuk kembali ke vektor dengan sistem enzim restriksi seperti promega karena Gateway masih terlalu mahal. Meskipun demikian, Wrobel mengatakan meskipun mahal, sistem ini sangat bermanfaat dan mudah digunakan. Menurut pengguna lainnya, Charles Buck dari Purdue University, sistem Gateway masih perlu diperbaiki karena masih banyak insert tidak tersisipkan ke dalam vektor dan terkadang sistem tidak bekerja dengan baik.
Sistem CRE/LOX
Sistem kloning CRE/LOX lebih awal dikembangkan daripada sistem fagi dan masih digunakan secara luas sampai saat ini. Sistem ini dilaporkan oleh Steve Elledge (Harvard University) dalam jurnal Current Biology pada saat beliau masih di Baylor College Medicine, 1998. Cre (diperoleh dari bakteriofage P1) mengkatalisis rekombinasi DNA antar fragmen 34 bp loxP. Vektor ini merupakan hasil penggabungan dari dua sistem yang masing-masing membawa satu loxP. Elledge menggunakan sistem ini untuk menempatkan gen penanda gluthionine-S-transferase di bagian depan gen pengkode Skp1.
Mountain Crew, Clontech-California membuat sistem yang dinamakan Creator menggunakan pendekatan yang sedikit berbeda. Donor plasmid dengan target sekuen diapit oleh fragmen loxP (disebut floxed) dan sebuah plasmid penerima yang memiliki satu loxP. Creator akan memindahkan sekuen floxed dari satu plasmid ke plasmid lain.
Sementara itu, La Jolla-Stratagene-California membuat sistem yang memungkinkan pemindahan salah satu dari tiga gen penanda pengkode hidromycin, puromycin dan neomycin ke dalam sebuah vektor menggunakan Cre. Keuntungan dari sistem ini, menurut Lisa Stilwell (manager produksi Stratagen untuk sistem ekspresi protein) adalah pengguna dapat memakai penanda gen tahan antibiotik yang berbeda tanpa harus melakukan kloning lagi dan juga tidak harus meligasi loxP dengan target insert sebelum melakukan kloning.
Sistem FLP/FRT
Sistem rekombinase lainnya adalah menggunakan enzim Flp yang diperoleh dari plasmid ragi. Enzim ini mengkatalisa rekombinasi antar fragmen frt dan invitrogen membuat sistem flp-in untuk kloning pada sel mamalia.
Sistem ini menggunakan sel lines yang mengandung satu fragmen frt yang diinsert ke daerah kromosom yang sering ditranskripsi. Semua kejadian rekombinasi dalam plasmid akan menghasilkan insert pada tempat yang sama, menghasilkan sel lines yang isogenik. Hal yang sedikit mengganggu adalah kita harus membuat juga sel yang ditransfeksi Flp-in.
Invitrogen menjual beberapa jenis flp-in sel lines seperti 293, 3T3 dan Jurkat. Sistem ini mencakup vektor pFRT/lacZeo, sebuah konstruksi rekombinase Flp dan vektor Flp-in pcDBA5/FRT.
Vektor selanjutnya
Sistem kloning dengan rekombinase mungkin akan laris di masa depan, tetapi sebagian besar produsen menutup diri dalam hal pengembangan teknologinya. Beberapa peneliti melakukan improvisasi teknik-teknik kloning tersebut dan kemudian mengharapkan adanya pembeli.
Michele Calos, Ass. Profesor bidang genetika dari Stanford University School of Medicine, sedang mempersiapkan komersialisasi produknya yang dinamakan PhiC31 yang bisa berguna untuk terapi gen. Dengan menginjeksikan cDNA integrase, plasmid yang memiliki fragmen attB dan gen pengkode human blood clothing factor IX (orang hemofilia kekurangan protein ini), menghasilkan ekspresi yang sama dengan orang normal. Hal ini dilaporkan dalam jurnal Nature Biotechnology. Calos mengatakan bahwa sistem ini dapat menurunkan secara signifikan resiko mutagenesis yang kadang terjadi bila menggunakan vektor yang sifatnya terintegrasi secara bebas.
Sistem kloning dengan bantuan rekombinase, memungkinkan peneliti dapat memindahkan DNA dari satu plasmid ke plasmid lain tanpa memerlukan enzim restriksi, sehingga menyederhanakan proses kloning. Selain itu juga bisa menjadi solusi atas masalah yang datang pada saat fragmen DNA (insert) yang akan kita sisipkan tidak memiliki tempat atau tempatnya tidak tepat.
Sistem seperti ini sangat berguna untuk memindahkan insert, dari suatu vektor ke vektor lain. Sebagai contoh sistem ini mempunyai tujuan untuk menandai protein di kedua ujung amino (N) dan karboksilnya (C), sehingga protein tersebut menjadi menyala atau tidak menyala, atau membuat konstruksi ekspresi pada sistem yang bervariasi. Beberapa metode telah dijelaskan secara detail, sampai saat ini sudah ada tiga jenis yang sudah dikomersialkan, yaitu Cre/Iox, Flp/Frt dan rekombinase lambda.
Sistem Gateway
Teknologi Gateway yang dikembangkan oleh invitrogen, Carlsbad-California menggunakan rekombinase lambda yang disebut sebagai Clonase yang mengkatalisa terjadinya rekombinasi secara in vitro antar sekuen yang diapit oleh fragmen 25 bp ATT. Seringkali, sekuen tersebut berada pada plasmid yang berbeda, bila memindahkan sebuah insert dari vektor donor (entry) ke vektor resipien (destination). Tetapi, invitrogen juga memiliki sistem untuk mengkloning fragmen DNA secara langsung ke dalam plasmid menggunakan Clonase, suatu sistem yang tidak memiliki enzim restriksi dan ligase. Dengan menggunakan kit konstruksi pustaka cDNA CloneMiner (harganya 1.221 dollar US dan dapat digunakan untuk 5 kali konstruksi). Pengguna dapat membuat pustaka cDNA utuh secara langsung ke dalam plasmid donor yang sesuai.
Perusahaan telah mendesain bermacam-macam vektor resipien yang bisa digunakan untuk mengganggu transkripsi RNA (dikenal dengan RNA interference), menandai target dengan gen yang menyala (fluorescent tag) dan ragi. Dengan demikian, sistem ini adalah sangat serbaguna seperti yang diungkapkan oleh Pieter de Jong (ketua peneliti di BACPAC, pusat penelitian dan rumah sakit anak, Oakland-California).
Sistem Gateway telah memberikan kemudahan kepada peneliti. Proyek ORFemoe pada Caenorhabditis elegans mendistribusikan 10.000 klon atau lebih ke dalam sistem Gateway dan tim kloning cDNA di pusat studi genom eukariotik (CESG) di universitas Winsconsin-Madison, telah menggunakan Gateway untuk membuat konstruksi ekspresi sekitar 4000-5000 buah.
Tetapi menurut salah seorang staf peneliti CESG, Russel Wrobel, tim merencanakan untuk kembali ke vektor dengan sistem enzim restriksi seperti promega karena Gateway masih terlalu mahal. Meskipun demikian, Wrobel mengatakan meskipun mahal, sistem ini sangat bermanfaat dan mudah digunakan. Menurut pengguna lainnya, Charles Buck dari Purdue University, sistem Gateway masih perlu diperbaiki karena masih banyak insert tidak tersisipkan ke dalam vektor dan terkadang sistem tidak bekerja dengan baik.
Sistem CRE/LOX
Sistem kloning CRE/LOX lebih awal dikembangkan daripada sistem fagi dan masih digunakan secara luas sampai saat ini. Sistem ini dilaporkan oleh Steve Elledge (Harvard University) dalam jurnal Current Biology pada saat beliau masih di Baylor College Medicine, 1998. Cre (diperoleh dari bakteriofage P1) mengkatalisis rekombinasi DNA antar fragmen 34 bp loxP. Vektor ini merupakan hasil penggabungan dari dua sistem yang masing-masing membawa satu loxP. Elledge menggunakan sistem ini untuk menempatkan gen penanda gluthionine-S-transferase di bagian depan gen pengkode Skp1.
Mountain Crew, Clontech-California membuat sistem yang dinamakan Creator menggunakan pendekatan yang sedikit berbeda. Donor plasmid dengan target sekuen diapit oleh fragmen loxP (disebut floxed) dan sebuah plasmid penerima yang memiliki satu loxP. Creator akan memindahkan sekuen floxed dari satu plasmid ke plasmid lain.
Sementara itu, La Jolla-Stratagene-California membuat sistem yang memungkinkan pemindahan salah satu dari tiga gen penanda pengkode hidromycin, puromycin dan neomycin ke dalam sebuah vektor menggunakan Cre. Keuntungan dari sistem ini, menurut Lisa Stilwell (manager produksi Stratagen untuk sistem ekspresi protein) adalah pengguna dapat memakai penanda gen tahan antibiotik yang berbeda tanpa harus melakukan kloning lagi dan juga tidak harus meligasi loxP dengan target insert sebelum melakukan kloning.
Sistem FLP/FRT
Sistem rekombinase lainnya adalah menggunakan enzim Flp yang diperoleh dari plasmid ragi. Enzim ini mengkatalisa rekombinasi antar fragmen frt dan invitrogen membuat sistem flp-in untuk kloning pada sel mamalia.
Sistem ini menggunakan sel lines yang mengandung satu fragmen frt yang diinsert ke daerah kromosom yang sering ditranskripsi. Semua kejadian rekombinasi dalam plasmid akan menghasilkan insert pada tempat yang sama, menghasilkan sel lines yang isogenik. Hal yang sedikit mengganggu adalah kita harus membuat juga sel yang ditransfeksi Flp-in.
Invitrogen menjual beberapa jenis flp-in sel lines seperti 293, 3T3 dan Jurkat. Sistem ini mencakup vektor pFRT/lacZeo, sebuah konstruksi rekombinase Flp dan vektor Flp-in pcDBA5/FRT.
Vektor selanjutnya
Sistem kloning dengan rekombinase mungkin akan laris di masa depan, tetapi sebagian besar produsen menutup diri dalam hal pengembangan teknologinya. Beberapa peneliti melakukan improvisasi teknik-teknik kloning tersebut dan kemudian mengharapkan adanya pembeli.
Michele Calos, Ass. Profesor bidang genetika dari Stanford University School of Medicine, sedang mempersiapkan komersialisasi produknya yang dinamakan PhiC31 yang bisa berguna untuk terapi gen. Dengan menginjeksikan cDNA integrase, plasmid yang memiliki fragmen attB dan gen pengkode human blood clothing factor IX (orang hemofilia kekurangan protein ini), menghasilkan ekspresi yang sama dengan orang normal. Hal ini dilaporkan dalam jurnal Nature Biotechnology. Calos mengatakan bahwa sistem ini dapat menurunkan secara signifikan resiko mutagenesis yang kadang terjadi bila menggunakan vektor yang sifatnya terintegrasi secara bebas.
0 komentar:
Posting Komentar