Sekuensing DNA

Satu dari terobosan utama dalam biologi molekuler adalah perkembangan metode mensekuen potongan DNA secara cepat. Pengurutan asam nukleat memungkinkan kita bisa mengetahui kode genetik dari molekul DNA. Sekuensing dapat dilakukan dengan menggunakan satu dari dua metode yang ada. Kedua metode tersebut menghasilkan fragmen-fragmen DNA dengan panjang bervariasi, yang satu sama lain berbeda sebanyak satu basa tunggal. Dari fragmen-fragmen tersebut, kita bisa menarik kesimpulan mengenai sekuen asam nukleat molekul DNA yang diperiksa. Teknik yang digunakan adalah gel-gel poliakrilamid pendenaturasi (denaturing polyacrilamide gels). Gel agarosa dapat memisahkan molekul-molekul DNA dengan perbedaan panjang 30-50 basa, sedangkan gel poliakrilamid dapat memisahkan molekul-molekul DNA dengan perbedaan panjang satu basa. Gel-gel pendenaturasi menyebabkan molekul DNA menjadi beruntai tunggal dan tetap dalam keadaan seperti itu sepanjang proses elektroforesis. Gel pendenaturasi mengandung urea dan dijalankan dengan suhu yang ditinggikan. Kedua hal tersebut mendorong terjadinya pemisahan kedua untai molekul DNA.

Agar dapat dilihat, DNA harus diberi label. Label yang paling sering digunakan adalah isotop radioaktif, terutama 32P, 33P atau 35P. Setelah elektroforesis, gel dikeringkan dan diletakkan dengan selembar film sinar-X dalam ruang gelap. Selama penyimpanan tersebut, partikel-partikel radioaktif yang dipancarkan dari isotop pada tiap molekul DNA memapar film. Setelah film dicuci, akan tampak pita hitam pada film di posisi pita DNA pada gel. Gambar ini disebut autoradiograf, merupakan bayangan cermin posisi pita DNA pada gel.
Ada dua metode yang dapat digunakan dalam mengurutkan molekul DNA. Metode Maxam-Gilbert merupakan metode yang didasarkan atas pemotongan DNA di daerah spesifik oleh zat-zat kimiawi selain enzim. Akan tetapi, metode ini sekarang jarang digunakan, metode Sanger lebih disukai dan keduanya diperkenalkan pada tahun 1977. Metode Sanger lebih mudah, praktis dan efisien.
Dalam metode Sanger, sintesis DNA secara enzimatik terjadi melalui pembentukan secara berurut ikatan fosfodiester antara gugus fosfat ujung 5’ bebas dari nukleotida baru dengan gugus OH dari ujung 3’ rantai yang sedang memanjang. Proses ini berlangsung sepanjang molekul DNA. Dideoksinuklotida tidak mempunyai gugus OH pada ujung 3’-nya, melainkan gugus H. Adanya dideoksinukleotida menyebabkan sintesis DNA terhenti, karena ikatan difosfat tidak terbentuk. Pemanjangan rantai akan terhenti pada titik ini dan basa terakhir di ujung 3’ rantainya adalah sebuah terminator dideoksi. Modifikasi dari metode Sanger ini disebut dideoxy termination sequencing.
Dalam metode pengurutan Sanger, digunakan empat macam campuran reaksi dalam pengurutan fragmen DNA. Tiap campuran reaksi mengandung molekul DNA cetakan yang akan diurutkan, primer yang telah diberi label dengan radioaktif, keempat deoksinukleotida, DNA polimerase dan empat terminator dideoksi (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP). Jika salah satu dari terminator ini digunakan pada untai DNA yang baru terbentuk, maka sintesis untai baru ini akan terhenti, hasilnya adalah semua untai dengan panjang yang bervariasi pada campuran reaksi akan berakhir dengan basa yang sama. Produk-produk radioaktif tersebut akan dipisahkan dengan elektroforesis dan divisualisasikan melalui autoradiografi. Hasil autoradiografi dibaca dari bawah gel (fragmen terpendek yang berhenti paling dekat dengan ujung 5’) ke arah atas untuk mengetahui sekuen basa komplementer dari untai cetakan.

Proyek-proyek Sekuensing Genom
Sejalan dengan berkembangnya mesin-mesin sekuensing DNA otomatis (Automatic DNA Sequencer), sejumlah organisasi telah memberikan perhatian dan dukungan dana bagi penentuan sekuen genom berbagai spesies organisme penting. Beberapa genom yang ukurannya sangat kecil seperti genom virus HIV dan fag λ telah disekuen seluruhnya. Genom sejumlah bakteri, misalnya E. coli (4,6 x 106 bp) dan khamir Saccharomyces cerevisiase (2,3 x 107 bp) juga telah selesai disekuensing. Sementara itu, proyek sekuensing genom tanaman Arabidopsis thaliana (6,4 x 107 bp) dan nematode Caenorhabditis elegans saat ini masih berlangsung. Proyek genom manusia (Human Genome Project), yang diluncurkan pada tahun 1990 dan sebenarnya diharapkan selesai pada tahun 2005, ternyata berakhir dua tahun lebih cepat daripada jadwal yang telah ditentukan.
Pada genom manusia dan genom-genom lain yang berukuran besar biasanya dilakukan pemetaan kromosom terlebih dahulu untuk mengetahui lokus-lokus gen pada tiap kromosom. Selanjutnya, perpustakaan gen untuk suatu kromosom dikonstruksi menggunakan vektor YACs dan klon YACs yang saling tumpang tindih diisolasi hingga panjang total kromosom tersebut akan tercakup. Demikian seterusnya untuk kromosom-kromosom yang lain hingga akhirnya akan diperoleh sekuen genom total yang sambung-menyambung dari satu kromosom ke kromosom berikutnya.

Pangkalan Data Sekuen DNA
Selama bertahun-tahun telah banyak sekuen DNA yang ditentukan oleh para ilmuwan di seluruh dunia dan saat ini kebanyakan jurnal ilmiah mengisyaratkan penyerahan sekuen DNA terlebih dahulu untuk keperluan data publik sebelum mereka menerima naskah selengkapnya dari para penulis/ilmuwan. Pengelola pangkalan data akan saling bertukar informasi tentang sekuen-sekuen yang terkumpul dan menyediakannya untuk akses publik sehingga semua pangkalan data yang ada akan menjadi nara sumber yang sangat bermanfaat.
Sekuen-sekuen baru terus bertambah dengan kecepatan yang kian meningkat. Begitu pula, sejumlah perangkat lunak komputer diperlukan agar data yang tersedia dapat dimanfaatkan dengan lebih baik.
EMBL di eropa dan GenBank Amerika Serikat merupakan dua pangkatalan data sekuen DNA terbesar di dunia. Selain sekuen DNA, mereka juga mengelola data sekuen RNA dan protein. Sementara itu, beberapa perusahaan mempunyai pangkalan data sekuen DNA sendiri.
Ketika sekuen suatu fragmen DNA telah diketahui, hanya ada sedikit sekali gambaran yang dapat diperoleh dari sekuen tersebut. Analisis sekuen perlu dilakukan untuk mengetahui beberapa karakteristik pentingnya seperti peta restriksi, rangka baca, kodon awal dan kodon akhir atau kemungkinan tempat promotornya. Di samping itu, perlu juga dipelajari hubungan kekerabatan suatu sekuen baru dengan beberapa sekuen lainnya yang telah terlebih dahulu diketahui. Biasanya, analisis semacam itu dilakukan menggunakan paket-paket perangkat lunak, misalnya paket GCG Universitas Wisconsin dan DNAstar.