Kendaraan merupakan salah satu alat untuk memindahkan sesuatu dari satu tempat ke tempat lain. Dalam bioteknologi rekayasa genetika yang telah melanda dunia saat ini, kendaraan juga diperlukan dan merupakan kebutuhan mutlak. Kendaraan yang digunakan dalam bioteknologi ini berfungsi sebagai alat untuk memindahkan gen (sepotong molekul DNA) dari satu organisme ke organisme hidup lain. Dalam bioteknologi, kendaraan tersebut dikenal dengan nama vector. Adapun gen yang bisa dipindahkan dapat berasal dari molekul DNA manusia, hewan, tumbuhan dan semua organisme hidup lainnya. Oleh karena jenis kendaraan ini berasal dari sel organisme hidup, kita sebut saja kendaraan ini sebagai biotransport.
Pada umumnya bakteri mempunyai satu kromosom berupa DNA sirkular. Namun, disamping memiliki kromosom tersebut, bakteri juga memiliki DNA sirkular lainnya yang ukurannya jauh lebih kecil daripada DNA kromosomnya. Materi ini disebut dengan plasmid yang merupakan DNA bakteri yang terpisah dari DNA kromosomnya. Plasmid merupakan satu dari beberapa jenis biotransport yang paling populer digunakan dalam bioteknologi rekayasa genetika. Beberapa karakteristik dari plasmid adalah molekul DNA utas ganda sirkuler (tidak berujung), berukuran kecil, terdapat dalam sitoplasma namun di luar kromosom (ekstra kromosom) dan dapat melakukan replikasi secara autonom, secara genetik dapat ditransfer dengan stabil, mengandung berbagai jenis gen. Jenis, jumlah jenis dan jumlah tiap jenis (copy) plasmid bervariasi antar sel. Bahkan antar sel dalam satu spesies bakteri. Plasmid terdapat di dalam sitoplasma organisme prokariot dan eukariot sederhana uniseluler. Selain dalam bakteri, plasmid juga terdapat dalam Saccharomyces cerevisiae. Pada kelompok prokariot, plasmid diketahui memiliki ukuran yang sangat bervariasi antara kurang dari 1 juta Dalton sampai 200 juta Dalton. Sifat fenotipe dari plasmid biasanya telah teridentifikasi, misalnya tahan terhadap antibiotik, memproduksi antibiotik, degradasi aroma, tahan terhadap logam berat, fermentasi gula dan lain-lain. Namun, ada pula plasmid yang belum teridentifikasi sifat fenotipe-nya dan disebut sebagai plasmid cryptic.
Dalam teknik rekayasa genetika, plasmid biasanya digunakan sebagai vektor untuk kloning. Plasmid juga dapat dipindahkan antar sel bakteri dengan cara konjugasi atau transformasi. Plasmid mulai digunakan sebagai vektor untuk mengklon gen tidak lama setelah David Jackson, Robert Simon dan Paul Berg berhasil membuat molekul DNA rekombinan itu pada tahun 1972. Dalam hal ini, plasmid digunakan sebagai pembawa fragmen DNA asing. Dengan kata lain, plasmid dikombinasikan dengan DNA asing. Plasmid rekombinan yang pertama kali berhasil bereplikasi di dalam sel bakteri adalah plasmid pSC101 yang telah dikonstruksi oleh Stanley Cohen dan Herbert Boyer (SC=Stanley Cohen).
Penamaan plasmid biasanya diawali dengan “p” diikuti oleh serangkaian kode yang menunjukkan identitas plasmid tersebut. Contoh plasmid yang umum digunakan sebagai vektor adalah pUC118, pUC119, pBR322. Plasmid-plasmid ini masing-masing membawa gen penanda resistensi terhadap antibiotik yang dapat digunakan sebagai dasar dalam seleksi koloni yang membawa plasmid dan yang tidak. Beberapa plasmid memiliki MCS (Multiple Cloning Site) pada gen lacZ yang menyandikan enzim β-galactosidase, sehingga memungkinkan melakukan seleksi biru putih. Jika vektor tersebut telah membawa gen tertentu, di belakang nama plasmid juga disertakan keterangan mengenai gen yang dibawanya (contoh: pAP01 (amyH), berarti plasmid hasil konstruksi ini mengandung gen amyH).
Untuk mengisolasi DNA plasmid dari keseluruhan genom yang dimiliki oleh bakteri, biasanya digunakan metode lisis alkali atau sentrifugasi dalam gradien CsCl. Kedua metode ini akan memisahkan DNA plasmid dari DNA kromosom berdasarkan kerapatannya. Pada metode lisis alkali, sel bakteri dilisis dalam suasana alkali sehingga dsDNA akan terdenaturasi menjadi ssDNA. Setelah dinetralkan, DNA plasmid yang berukuran lebih kecil dibandingkan DNA kromosom akan lebih cepat mengalami renaturasi. Selanjutnya dengan sentrifugasi keduanya dapat dipisahkan. Metode ini dapat menghasilkan plasmid dengan kemurnian yang tinggi.
Berdasarkan metode lisis alkali, sekarang ini telah banyak dikembangkan suatu kit untuk isolasi plasmid. Dibandingkan dengan metode lisis alkali konvensional, dengan menggunakan kit, pekerjaan menjadi lebih cepat dan mudah. Untuk mendapatkan kemurnian yang tinggi, biasanya kit semacam ini menggunakan agen pengikat DNA dalam bentuk beads atau spin column yang akan mengikat DNA dengan kuat sehingga pengotor lainnya dapat dihilangkan saat pencucian. Setelah itu, DNA dapat diperoleh kembali dengan menambahkan suatu larutan yang dapat melepaskan ikatan antara DNA dengan agen tersebut (proses elusi).
Gambar 1. Beberapa contoh site map Plasmid
Salah satu contoh plasmid yang telah lama digunakan sebagai vektor untuk mengklon gen adalah plasmid pBR322. Plasmid tersebut mengandung gen penyandi resistensi terhadap ampisilin dan tetrasiklin. Pada gambar di bawah ditunjukkan adanya berbagai situs yang telah dipotong oleh enzim restriksi. Adanya gen resistensi terhadap antibiotik di dalamnya mengandung situs enzim restriksi yang akan memberikan kemudahan dalam menyeleksi plasmid rekombinan atau memudahkan dalam menyeleksi klon bakteri yang telah membawa plasmid rekombinan. Akan lebih memudahkan lagi dengan adanya enzim yang memotong pada bagian gen resistensi terhadap antibiotik. Misalnya enzim PstI yang hanya akan memotong pBR322 pada bagian gen resistensi terhadap ampisilin (gen ApR).
Contoh plasmid lainnya yang telah lama digunakan sebagai vektor untuk mengklon gen adalah plasmid pUC118 dan pUC119. Plasmid ini merupakan pengembangan dari pBR322. Plasmid pUC118 dan pUC119 mengandung gen lacZ yang menyandikan enzim β-galaktosidase. Pada lacZ terdapat daerah yang disebut daerah polikloning. Pada daerah ini terdapat banyak situs restriksi dari berbagai enzim restriksi. Dalam hal ini, kita dapat menggunakan berbagai enzim restriksi untuk memotong pUC118 dan pUC119 pada bagian lacZ. Bila gen lacZ disisipi oleh DNA asing maka gen lacZ tersebut tidak berfungsi (tidak menghasilkan β-galaktosidase). Bila kita menggunakan pUC118 atau pUC119 sebagai vektor, maka koloni yang membawa plasmid rekombinan dapat dideteksi dengan menggunakan Xgal (5-bromo-4-chloro-indolyl-β-D-galactosida). Enzim β-galaktosidase akan memecah Xgal menjadi galaktosa dan 5-bromo-4-chloroindigo yang berwarna biru. Koloni bakteri akan berwarna putih bila pUC118 atau pUC119 telah disisipi DNA asing pada bagian lacZ. Dalam hal ini sel bakteri tidak menghasilkan enzim β-galaktosidase karena gen lacZ. Gen lacZ tidak berfungsi karena disisipi oleh DNA asing.
Dari beberapa perangkat di atas (enzim restriksi, enzim DNA ligase dan plasmid) telah memungkinkan bagi kita untuk mengklonkan gen atau fragmen DNA. Dalam hal ini, kita dapat membuat plasmid rekombinan (plasmid yang mengandung fragmen DNA asing) di dalam tabung reaksi. Bila dikombinasikan dengan salah satu cara bakteri memindahkan DNA yaitu transformasi, kita dapat memasukkan plasmid rekombinan tersebut ke dalam sel bakteri.
Pada umumnya bakteri mempunyai satu kromosom berupa DNA sirkular. Namun, disamping memiliki kromosom tersebut, bakteri juga memiliki DNA sirkular lainnya yang ukurannya jauh lebih kecil daripada DNA kromosomnya. Materi ini disebut dengan plasmid yang merupakan DNA bakteri yang terpisah dari DNA kromosomnya. Plasmid merupakan satu dari beberapa jenis biotransport yang paling populer digunakan dalam bioteknologi rekayasa genetika. Beberapa karakteristik dari plasmid adalah molekul DNA utas ganda sirkuler (tidak berujung), berukuran kecil, terdapat dalam sitoplasma namun di luar kromosom (ekstra kromosom) dan dapat melakukan replikasi secara autonom, secara genetik dapat ditransfer dengan stabil, mengandung berbagai jenis gen. Jenis, jumlah jenis dan jumlah tiap jenis (copy) plasmid bervariasi antar sel. Bahkan antar sel dalam satu spesies bakteri. Plasmid terdapat di dalam sitoplasma organisme prokariot dan eukariot sederhana uniseluler. Selain dalam bakteri, plasmid juga terdapat dalam Saccharomyces cerevisiae. Pada kelompok prokariot, plasmid diketahui memiliki ukuran yang sangat bervariasi antara kurang dari 1 juta Dalton sampai 200 juta Dalton. Sifat fenotipe dari plasmid biasanya telah teridentifikasi, misalnya tahan terhadap antibiotik, memproduksi antibiotik, degradasi aroma, tahan terhadap logam berat, fermentasi gula dan lain-lain. Namun, ada pula plasmid yang belum teridentifikasi sifat fenotipe-nya dan disebut sebagai plasmid cryptic.
Dalam teknik rekayasa genetika, plasmid biasanya digunakan sebagai vektor untuk kloning. Plasmid juga dapat dipindahkan antar sel bakteri dengan cara konjugasi atau transformasi. Plasmid mulai digunakan sebagai vektor untuk mengklon gen tidak lama setelah David Jackson, Robert Simon dan Paul Berg berhasil membuat molekul DNA rekombinan itu pada tahun 1972. Dalam hal ini, plasmid digunakan sebagai pembawa fragmen DNA asing. Dengan kata lain, plasmid dikombinasikan dengan DNA asing. Plasmid rekombinan yang pertama kali berhasil bereplikasi di dalam sel bakteri adalah plasmid pSC101 yang telah dikonstruksi oleh Stanley Cohen dan Herbert Boyer (SC=Stanley Cohen).
Penamaan plasmid biasanya diawali dengan “p” diikuti oleh serangkaian kode yang menunjukkan identitas plasmid tersebut. Contoh plasmid yang umum digunakan sebagai vektor adalah pUC118, pUC119, pBR322. Plasmid-plasmid ini masing-masing membawa gen penanda resistensi terhadap antibiotik yang dapat digunakan sebagai dasar dalam seleksi koloni yang membawa plasmid dan yang tidak. Beberapa plasmid memiliki MCS (Multiple Cloning Site) pada gen lacZ yang menyandikan enzim β-galactosidase, sehingga memungkinkan melakukan seleksi biru putih. Jika vektor tersebut telah membawa gen tertentu, di belakang nama plasmid juga disertakan keterangan mengenai gen yang dibawanya (contoh: pAP01 (amyH), berarti plasmid hasil konstruksi ini mengandung gen amyH).
Untuk mengisolasi DNA plasmid dari keseluruhan genom yang dimiliki oleh bakteri, biasanya digunakan metode lisis alkali atau sentrifugasi dalam gradien CsCl. Kedua metode ini akan memisahkan DNA plasmid dari DNA kromosom berdasarkan kerapatannya. Pada metode lisis alkali, sel bakteri dilisis dalam suasana alkali sehingga dsDNA akan terdenaturasi menjadi ssDNA. Setelah dinetralkan, DNA plasmid yang berukuran lebih kecil dibandingkan DNA kromosom akan lebih cepat mengalami renaturasi. Selanjutnya dengan sentrifugasi keduanya dapat dipisahkan. Metode ini dapat menghasilkan plasmid dengan kemurnian yang tinggi.
Berdasarkan metode lisis alkali, sekarang ini telah banyak dikembangkan suatu kit untuk isolasi plasmid. Dibandingkan dengan metode lisis alkali konvensional, dengan menggunakan kit, pekerjaan menjadi lebih cepat dan mudah. Untuk mendapatkan kemurnian yang tinggi, biasanya kit semacam ini menggunakan agen pengikat DNA dalam bentuk beads atau spin column yang akan mengikat DNA dengan kuat sehingga pengotor lainnya dapat dihilangkan saat pencucian. Setelah itu, DNA dapat diperoleh kembali dengan menambahkan suatu larutan yang dapat melepaskan ikatan antara DNA dengan agen tersebut (proses elusi).
Gambar 1. Beberapa contoh site map Plasmid
Salah satu contoh plasmid yang telah lama digunakan sebagai vektor untuk mengklon gen adalah plasmid pBR322. Plasmid tersebut mengandung gen penyandi resistensi terhadap ampisilin dan tetrasiklin. Pada gambar di bawah ditunjukkan adanya berbagai situs yang telah dipotong oleh enzim restriksi. Adanya gen resistensi terhadap antibiotik di dalamnya mengandung situs enzim restriksi yang akan memberikan kemudahan dalam menyeleksi plasmid rekombinan atau memudahkan dalam menyeleksi klon bakteri yang telah membawa plasmid rekombinan. Akan lebih memudahkan lagi dengan adanya enzim yang memotong pada bagian gen resistensi terhadap antibiotik. Misalnya enzim PstI yang hanya akan memotong pBR322 pada bagian gen resistensi terhadap ampisilin (gen ApR).
Contoh plasmid lainnya yang telah lama digunakan sebagai vektor untuk mengklon gen adalah plasmid pUC118 dan pUC119. Plasmid ini merupakan pengembangan dari pBR322. Plasmid pUC118 dan pUC119 mengandung gen lacZ yang menyandikan enzim β-galaktosidase. Pada lacZ terdapat daerah yang disebut daerah polikloning. Pada daerah ini terdapat banyak situs restriksi dari berbagai enzim restriksi. Dalam hal ini, kita dapat menggunakan berbagai enzim restriksi untuk memotong pUC118 dan pUC119 pada bagian lacZ. Bila gen lacZ disisipi oleh DNA asing maka gen lacZ tersebut tidak berfungsi (tidak menghasilkan β-galaktosidase). Bila kita menggunakan pUC118 atau pUC119 sebagai vektor, maka koloni yang membawa plasmid rekombinan dapat dideteksi dengan menggunakan Xgal (5-bromo-4-chloro-indolyl-β-D-galactosida). Enzim β-galaktosidase akan memecah Xgal menjadi galaktosa dan 5-bromo-4-chloroindigo yang berwarna biru. Koloni bakteri akan berwarna putih bila pUC118 atau pUC119 telah disisipi DNA asing pada bagian lacZ. Dalam hal ini sel bakteri tidak menghasilkan enzim β-galaktosidase karena gen lacZ. Gen lacZ tidak berfungsi karena disisipi oleh DNA asing.
Dari beberapa perangkat di atas (enzim restriksi, enzim DNA ligase dan plasmid) telah memungkinkan bagi kita untuk mengklonkan gen atau fragmen DNA. Dalam hal ini, kita dapat membuat plasmid rekombinan (plasmid yang mengandung fragmen DNA asing) di dalam tabung reaksi. Bila dikombinasikan dengan salah satu cara bakteri memindahkan DNA yaitu transformasi, kita dapat memasukkan plasmid rekombinan tersebut ke dalam sel bakteri.
0 komentar:
Posting Komentar